关节腔内注射医用臭氧对兔膝骨性关节炎的影响及最佳浓度探讨

庾俊雄，徐 恒，谭永星，邹国耀

(桂林医学院附属医院，广西桂林 541001)

膝骨性关节炎(OA)是中老年人常见病，目前临床多以药物和物理疗法治疗，且效果多不满意[1]。臭氧具有较强的消炎、止痛作用，有资料表明关节腔内注射臭氧对 OA有治疗作用[2]。2010年，我们观察了医用臭氧对 OA关节软骨及关节液中 NO的影响，探讨其治疗膝骨性关节炎的最佳浓度。

1 材料与方法

1.1 材料 6～8个月龄健康大耳白兔 32只，雌雄不拘，体质量 2.0～2.5 kg。随机分为空气组及臭氧低、中、高剂量组各 8只。各组分笼饲养 1周适应环境后进行实验。一氧化氮(NO)测定试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，医用臭氧发生器，为德国赫尔曼公司产品。

1.2 OA模型的建立及干预 每组右膝关节均按Hulth法[3]复制出膝骨性关节炎(OA)模型:麻醉后，从膝关节内侧切断兔右膝关节内侧副韧带和前后交叉韧带，切除内侧半月板，缝合关节囊及皮肤。自造模日起，每日上午驱赶动物活动 15 min，共 4周;左膝关节作为对照。4周后空气组右膝关节腔内注入空气 2 ml，臭氧低、中、高剂量组分别予膝关节腔内注射 25、40、80 μg/ml医用臭氧 2 ml，1次/周 ，共 4周 。

1.3 相关指标检测 ①膝关节活动度 :分别于造模前、造模成功后及处死动物前采用量角器测量膝关节屈伸最大角度，每膝关节测量 3次，取其平均值。②关节软骨病理改变:治疗完成 3 d后将动物麻醉后固定，抽取 1 ml生理盐水注入右膝关节腔，充分活动膝关节后抽出关节腔内液体、暴露膝关节腔，大体观察股骨髁和胫骨平台，于股骨髁内侧小心取软骨组织 3 mm×3 mm，厚约 0.5 mm，置入 10%中性甲醛溶液内固定，石蜡包埋。肉眼观察关节软骨色泽、表面光滑度、纤维化、糜烂溃疡或骨赘形成发生情况;HE染色观察关节软骨表面是否规则、潮线是否完整、软骨细胞排列是否规则、软骨细胞数量、软骨表层纤维性成分多少等;甲苯胺蓝(TB)染色观察软骨组织结构、软骨细胞数量，TB着色情况和潮线的完整性。使用 Mankin′s评分[4]评估软骨损伤情况，分数越高说明软骨损伤越重。③关节液中 NO表达检测:将关节腔灌洗液稀释后，采用硝酸还原酶法测定 NO含量。

1.4 统计学方法 采用 SPSS18.0统计软件。所有计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对样本 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝关节活动度 各组右膝关节活动度比较见表1。

表1 各组膝关节活动度比较(n=8，°，±s)

表1 各组膝关节活动度比较(n=8，°，±s)

注:与造模前比较，*P＜0.01;与造模成功时比较，△P＜0.05

组别 造模前 造模成功时 处死前即刻A组 162.1±4.9 106.1±3.3* 104.5±2.6 B组 162.5±3.9 106.0±2.6* 148.9±4.2△C组 161.5±3.3 102.9±3.1* 135.4±2.1△D组 160.8±5.1 104.9±2.6* 129.3±3.4△

2.2 膝关节软骨病理改变 肉眼观察:左膝关节软骨表面光滑，淡蓝色半透明状，软骨边缘无骨赘形成。右膝空气组软骨表面粗糙，表面横纵裂隙不规则，关节面糜烂溃疡，内髁软骨边缘有少量骨赘形成，低剂量组软骨表面较光滑，颜色较暗，可见关节面糜烂，较少见溃疡，中、高剂量组软骨表面粗糙呈颗粒状，裂纹及糜烂较低剂量组多见。光镜下观察:空气组软骨表面粗糙不规则，裂隙较多，软骨纤维细胞增多，软骨细胞数量明显减少，排列紊乱，臭氧低剂量组软骨表面较规则，裂隙及纤维细胞较空气组减少，软骨细胞数量减少，散在分布，排列尚整齐，TB染色轻度减退，中、高剂量组软骨细胞明显减少，排列紊乱，有簇样增生，潮线不完整，TB染色中、重度减退。空气组和臭氧低、中、高剂量组关节软骨的Mankin评分分别为(7.6±0.5)、(4.9±0.6)、(5.5±0.5)、(6.9±0.8)分。与空气组比较，臭氧低、中、高剂量组右膝关节软骨 Mankin评分降低(P＜0.05)，其中低剂量组 Mankin评分降低程度最大。

2.3 关节液 NO含量 空气组和臭氧低、中、高剂量组 NO含量分别为(139.0±10.4)、(96.8±9.8)、(109.5±13.1)、(116.5±16.1)μmol/L，均明显高于左膝的(34.1±3.4)μmol/L(P均 ＜0.05);与空气组比较，臭氧低、中、高剂量组膝关节液中 NO含量明显降低(P＜0.05)，其中低剂量组降低程度最大。

3 讨论

近年来的研究显示，NO在 OA的病理发展过程中发挥重要的生物学作用。关节内 NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化生成。NOS有两种亚型，包括结构型一氧化氮合成酶(cNOS)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)。iNOS介导产生的 NO对组织有损伤作用，其通过间接表达促炎症因子使 OA病变持续，抑制胶原蛋白和蛋白聚糖合成及诱导细胞凋亡。而cNOS介导产生的 NO对组织有疼痛缓解作用，且能减少 iNOS和 OA病理过程中产生 NO的有害作用。NO作用是双重而复杂的[5，6]。OA时膝关节的正常力学轴线被破坏，关节最大压力承受面由外侧胫骨平台转至内侧胫骨平台与股骨内侧髁，加之切断交叉韧带引起的关节不稳定，局部关节软骨所承受的压力相对增加，从而使软骨发生变性。

关节软骨分泌的 NO在 OA发生时生成增加，过量的 NO可抑制基质合成，促进基质降解;由于与超氧化物阴离子等氧化剂的反应，NO促使细胞损伤，使软骨细胞对细胞因子诱导的凋亡更敏感[7]。在体外实验中，人滑膜纤维母细胞在体外培养时无NO产生，当加入 IL-1β、TNF-α等后可活化其中的iNOS，产生大量 NO。IL-1β通过 NO促使人软骨细胞基质金属蛋白酶的合成，而 NOS抑制剂可抑制IL-1β诱导的基质金属蛋白酶的表达。

臭氧治疗 OA的机理可能为臭氧通过刺激氧化酶过度表达，抗炎和抑制免疫性反应，扩张血管、改善回流，促进炎症因子和 NO的吸收;还可直接作用于神经末梢，刺激抑制性中间神经元释放脑啡肽等物质，达到镇痛效果。目前臭氧治疗 OA的最佳浓度尚无定论。本研究结果显示，25μg/ml医用臭氧能改善 OA模型兔膝关节的活动度，降低关节液内NO浓度，对减轻 OA的关节软骨损伤也有一定作用，提示 25μg/ml医用臭氧可改善 OA模型兔膝关节内环境和关节运动功能。而 40、80μg/ml臭氧注入关节腔后仅膝关节活动度明显改善，但其病理学检查与 25μg/ml者比较并无明显改善，可能是由于臭氧强大的氧化作用，使关节软骨中的蛋白多糖和Ⅱ型胶原氧化，影响软骨细胞和基质的增殖能力。而臭氧对兔膝关节炎关节软骨的远期作用及临床疗效的评价，还需要进行更加深入的研究。

本研究发现，三种浓度的臭氧均能减轻 OA的炎症反应;但 40、80μg/ml浓度时可能导致关节软骨组织结构破坏，应引起临床重视。

[1]肖晓山.膝关节骨性关节炎的治疗进展[J].中国临床康复，2003，7(29):3996-3997.

[2]Bocci VA.Scientific and medical aspects of ozone therapy state of the art[J].Arch Med Res，2006，37(4):425-435.

[3]Hulth A，Lindberg L，Telhag H.Experimental osteoarthritis in rabbits:preliminary report[J].Acta Orthop Scand，1970，41(5):552.

[4]Kuroki H，Nakagawa Y，Mori K，et al.Acoustic stiffness and change in plug cartilage over time after autologous osteochondral grafting:correlation between ultrasound signal intensity and histological score in a rabbit model[J].Arthritis Res Ther，2004，6(6):492-504.

[5]Hancock CM，Riegger-Krugh C.Modulation of pain in osteoarthritis:the role of nitric oxide[J].Clin J Pain，2008，24(4):353-365.

[6]Abramson SB.Osteoarthritis and nitric oxide[J].Osteoarth Cart，2008，16(Suppl 2):15-20.

[7]Scher JU，Pillinger MH，Abramson SB.Nitric oxide synthases and osteoarthritis[J].Curr Rheumat Rep，2007，9(1):9-15.