NIV毒素和硒对软骨细胞CD44代谢的影响

曹珮华，曹峻岭，曹励民，杨亚娟，李蔚勃

(1西安医学院检验教研室，西安 710021;2西安交通大学医学院地方病研究所)

大骨节病(KBD)是一种原因不明的慢性、变形性、地方性骨关节病。真菌毒素中毒及缺硒是 KBD重要的病因学说[1]。CD44是软骨细胞表面表达的一类信息分子，对于维持关节软骨基质蛋白聚糖的代谢平衡及结构完整具有非常重要的作用。2009年，我们观察了雪腐镰刀菌烯醇(NIV)毒素和硒缺乏对体外培养胎儿软骨细胞 CD44表达的影响，旨在进一步探讨 KBD的发病机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 NIV毒素(日本和光纯药工业株氏会社);Na2SeO3.5H2O(重庆俞州精细化工厂);DME/F-12培养基、胰蛋白酶 (Gibco);透明质酸酶、Ⅱ型胶原酶 (Sigma);Trizol(Invitrogen);反转录试剂盒和PCR试剂盒(Frementas);sCD44ELISA试剂盒(Genzyme);CD44单克隆抗体(博士德生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养及干预 取 4月龄引产胎儿软骨细胞进行原代分离、培养[2]，当软骨细胞长成单层后，胰酶消化并进行传代。按照 40万个细胞/瓶接种于培养瓶后，置于 CO2培养箱 37℃培养。稳定 24 h后将细胞随机分为四组:对照组不处理，加硒组加入硒质量浓度为 0.1 mg/L，雪腐镰刀菌烯醇毒素(NIV)组加入 NIV毒素使终质量浓度为 0.1 mg/L，联合组加硒和 NIV毒素，浓度同上。48 h换培养液1次，作用 5 d后，收集细胞培养液待检。

1.3 CD44mRNA及 CD44蛋白检测 CD44mRNA:检测过程于冰面上操作。每个培养瓶中加入 1 ml Trizol裂解液，室温静置 5 min。加入 0.2 ml氯仿，震荡混匀后离心。加入 0.5 ml异丙醇，室温静置 10 min。4℃离心后加入 75%乙醇 1 ml洗涤振荡，4℃离心后将 RNA沉淀溶于 30μl DEPC中。取 6μl的RNA模板，分步加入 oligo-dT、RNA酶抑制剂、MMulV反转录酶等逆转录 cDNA链。采用 25μl PCR反应体系扩增目的基因双链，预变性:94℃ 2 min;变性:94℃ 30 s;退火:65℃ 1 min;延伸:70℃ 2 min;40个循环后 70℃再延伸 7 min。2%琼脂糖凝胶 80 V电压，电泳 45 min。经凝胶图像采集系统分析，根据 CD44条带与 GAPDH条带的灰度比值，为目的基因表达的半定量。CD44蛋白:收集各组培养细胞，除对照组外，加入 FITC-CD44抗体 (10 μl/管 )，37℃避光孵育 30 min;1 500 r/min离心 10 min，离心 2次。弃上清，加入 500μl PBS混匀，用单色激光在488 nm发射光激活细胞进行检测，计算阳性率(%)。

1.4 细胞培养液中可溶性 CD44(sCD44)浓度检测

除空白孔外，分别将不同浓度标准品或细胞培养液(100μl/孔)加入相应孔中 ，室温孵育 60 min，洗板。除空白孔外，加入第一抗体工作液(50μl/孔)，室温孵育 30 min，洗板。除空白孔外，加入酶标抗体工作液(100 μl/孔 )，室温孵育 30 min，洗板 。加入底物工作液(100μl/孔)，避光室温孵育 20 min。加入终止液，测量 OD450值。将所测 sCD44的 OD值减去空白的 OD值，制作标准曲线，查出浓度值。

1.5 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件。各组计量数据以±s表示，组间比较采用 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组软骨细胞 CD44mRNA及蛋白表达 见表1。

表1 各组软骨细胞 CD 44 mRNA及蛋白表达

2.2 各组培养液中 sCD44表达 联合组培养液中sCD44为 (40.35±8.23)μg/L，HIV组为(43.53±9.36)μg/L，加硒组为 (29.18 ±4.85)μg/L，对照组为(27.44±6.13)μg/L，对照组与其他三组比较，P＜0.05;联合组与 HIV组比较，P＜0.05。

3 讨论

NIV是由多种镰刀菌产生的一种真菌毒素，主要污染粮谷物及其制品，在 KBD区检测粮食时发现NIV毒素污染率明显高于非病区[3]。研究表明，NIV毒素可阻碍软骨细胞的分裂和增殖，引起软骨生物化学代谢障碍，导致关节软骨坏死[4]。因而KBD可能与 NIV毒素具有一定的相关性。KBD是骨关节病和软骨疾患较为特殊的类型，最主要的病理变化是关节软骨的变性坏死，软骨基质代谢紊乱。软骨细胞外基质的主要成分之一是蛋白聚糖，蛋白聚糖聚合物通常是由 100条蛋白聚糖单体经连接蛋白结合在透明质酸(HA)长链的两侧而形成。而CD44作为胞膜和基质 HA受体可以影响 HA的代谢，继而影响到软骨基质蛋白聚糖的代谢平衡，使软骨细胞生存内环境恶化，最终导致软骨细胞变性坏死，软骨组织损毁。

CD44是一种跨膜糖蛋白，属于细胞表面黏附分子家族，具有多种功能和结构形态，参与许多生物学活动，包括细胞迁移、肿瘤发生、转移以及免疫反应的调节等[5]。正常情况下，机体表达一定量的CD44;CD44异常升高，与许多疾病有关，如动脉粥样硬化、肿瘤扩散以及骨关节疾病等。sCD44广泛存在于人体的各种体液中，如血液、淋巴液、关节滑液等，其功能目前还不清楚。有研究表明，sCD44最主要的来源是从细胞膜 CD44水解脱落形成的[6]。

研究显示，KBD患者软骨组织 CD44表达明显，血清中 sCD44增加[7]，而正常人 CD44表达为阴性或弱阳性，提示在 KBD发生、发展过程中 CD44的表达及代谢调控发生改变。风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)患者软骨细胞中 CD44mRNA表达升高，其关节软骨坏死处软骨细胞 CD44的表达显著降低，而关节滑液中 sCD44含量则显著升高，并呈一定的量效关系[8，9]。这些结果提示 KBD时关节软骨代谢改变机制与 RA、OA存在相似之处，又有着显著不同。本研究发现，在 NIV毒素作用下，软骨细胞 CD44mRNA及 CD44蛋白表达急剧增加;而加硒后稍有降低。加入 NIV毒素及硒后 CD44表达有所恢复，但不明显。NIV组细胞培养液中 sCD44显著增高，加硒后趋势不变。由此可见，真菌毒素致实验性软骨损伤黏附分子 CD44的代谢紊乱与 KBD及其他骨关节病有相似之处。

由以上结果，我们推测:①NIV毒素作用于软骨细胞首先通过其毒理作用使得大量细胞表面黏附分子 CD44脱落，进而刺激软骨细胞产生大量 CD44，因而表现为 CD44mRNA、CD44蛋白以及 sCD44均升高;同时大量细胞表面 CD44分子又促进 HA内在化，导致细胞外 HA减少，进而使得结合其上的蛋白聚糖解聚、丢失，胞外基质代谢失衡，最终导致软骨细胞变性、坏死。②硒对 NIV毒素所造成的损伤具有一定的保护作用，但对正常软骨细胞的作用非常有限。当硒对抗毒素的损伤作用时，软骨细胞表面信息分子 CD44脱落减少，因而 CD44表达比毒素组降低;后者使得胞外 HA与其受体 CD44达到较好的平衡状态，因而胞外基质代谢相对平衡。提示补硒可以在一定程度上拮抗 NIV毒素对软骨细胞的毒性作用，但保护作用有限，不能从根本上防止损伤的发生。

综上所述，NIV毒素和缺硒是影响体外培养软骨细胞 CD44代谢紊乱的重要因素，但它们是否为KBD的病因，还需进一步研究证实。

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