温敏型核雄性不育系番茄T4育性的研究

王先裕 于分弟 梁聪耀 李良劭 黄维娜 杜永臣 刘政国 曾东 潘立凡

（1广西大学农学院，广西 南宁 530004；2融安县经济作物推广站，广西 柳州 545400；3中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；4广西壮族自治区政府，广西 南宁 530012；5南宁市青秀区农林水利局，广西 南宁 530213；6国家大宗蔬菜产业技术体系桂林综合试验站，广西 桂林 541004）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是较早利用杂种优势的蔬菜作物之一，一代杂种较常规品种产量提高20 %～30 %。利用雄性不育系不但减少了去雄这个繁杂的工序，而且降低了授粉难度，提高了育种效率，有效地保证了种子纯度。雄性不育系已在多种作物育种中发挥了巨大的作用，因此，对不育系的寻找、探索成为研究者不断努力的方向。

对不育机理的研究已有很多报道。对高粱（傅鸿仪，1983）、T型小麦（藤晓月和陈雪晖，1996）不育系和保持系的苗期叶片和幼穗期叶片的研究表明与育性相关的蛋白不在叶片中表达。Zhang和Chen（2001）用SDS-PAGE电泳直接检测了茎用芥菜胞质雄性不育系花器中特异蛋白质的表达。陈蕊红等（2009）研究推测不育系（S）-1376A雄性不育性可能与物质能量代谢、细胞程序化死亡及花发育调控等生理生化代谢有关。Sheoran等（2009）研究表明番茄细胞绒毡层的推后或提前降解都会导致雄性不育，而且在 7B-1中几种蛋白质的表达很可能影响花粉发育。

高温可使番茄花粉减少，而且随着高温时间的延长，花粉的减少量也增加，不育度也增强，尤其夜温对不育性的影响较大（Peet & Batholomew，1996；Pressman et al.，2002）。Singh和Sawhney（1998）研究发现，低温可使番茄 sl－2的育性恢复。陈丽等（2009）对番茄温敏型功能型雄性不育生理机制进行研究，发现影响材料T431花柱伸长、育性转换的最敏感时期为花芽分化期，即两叶一心期，最敏感的温度为18 ℃/10 ℃（昼/夜）。

本试验主要从花粉发芽率、自交结实率、果实种子数及叶片和花药蛋白质差异的角度，探求温敏型雄性不育系番茄T4育性转换的临界温度，同时研究影响T4表现为不育的外在表现及内在机理，为番茄育种开拓新的可利用资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为温敏型核雄性不育系番茄T4和对照可育系First，均由日本冈山大学农学部作物繁殖研究室桝田正治教授提供。T4为原种First经γ射线辐照后所得的变异突变体，夜温在20 ℃以上时，T4表现出稳定的雄性不育性；夜温在20 ℃以下时，T4可恢复部分育性（Masaharu & Ojiewo，2006）。T4和对照First于 2009年8月～2010年4月种于广西大学实验楼人工培养箱中。

1.2 试验方法

采用3台人工气候箱分别设定3个相同昼温为28 ℃、不同夜温（12、18、24 ℃）的处理，每天光照12 h（7：00～19：00）。幼苗3片真叶时，选择生长状况良好且长势相似的3株First和9株T4，分别移入3台人工气候箱中，每台气候箱种植1株First及3株T4，水肥管理一致。至开花期，采集当天开放的花朵，取其花粉在25 ℃条件下培养2 h，调查花粉发芽率；采集生殖生长期的第2或第3片功能叶及当天开放的花，在-80 ℃下保存，用于进行蛋白质差异性分析；于果实成熟期，统计前3果穗自交结实率和果实种子数。

蛋白质提取方法：将备用的各处理番茄叶片、花药分别称取0.2 g和0.1 g，在冰浴条件下用样品蛋白质提取液迅速研磨，磨成匀浆后倒入5 mL离心管中（放置冰盒中），然后于4 ℃冷冻条件下5000 r·min-1离心20 min。离心后取上层清液，分装并贴好标签，存于-80 ℃冰箱待用。电泳方法：Tricine-SDS-PAGE测定低分子量蛋白质法（胡天桥，2009）。电泳仪器：Power Pac HCTW电泳仪、Mini Protean 3well垂直电泳槽。

迁移率（R）=蛋白质迁移的距离/溴酚蓝迁移的距离

1.3 数据处理

试验数据采用DPS6.55软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同温度处理对T4花粉发芽率、自交结实率及果实种子数的影响

由表1可知，28 ℃/24 ℃和28 ℃/12 ℃处理的T4花粉发芽率分别为26.9 %和30.1 %，极显著低于对照；而28 ℃/18 ℃处理的T4花粉发芽率为54.3 %，与对照差异不显著。表明28 ℃/18 ℃处理的T4花粉活性强，而其他两个温度处理的T4花粉活性弱，说明T4具有温敏特性；夜温为18 ℃时T4和对照的花粉发芽率最高，分别为54.3 %和63.1 %，此时T4恢复部分育性。

自交结实率除了28 ℃/18 ℃处理的T4和对照差异不显著外，其他两个处理T4与对照都达到极显著差异水平，与花粉发芽率表现一致。表明高夜温影响花粉活力，最终表现为影响自交结实率；夜温为18 ℃的T4恢复部分育性，表现出高的自交结实率。

夜温分别为24 ℃和12 ℃的处理T4的单果种子数都极显著低于对照，说明T4在这两个温度下育性低，表现为不育，与自交结实率分析得到的结论一致，T4的最适夜温为18 ℃。

花粉发芽率、自交结实率和果实种子数间均存在极显著正相关关系，相关系数 r1，2=0.99、r1、3=0.94、r2、3=0.98。表明当花粉活性增高时，自交结实率提高，单果种子数也随之增加。

表1 不同温度处理对T4花粉发芽率、自交结实率及果实种子数的影响

2.2 Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析

图1 Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图

由图1和表2可知，夜温为18 ℃的处理T4花药中蛋白质谱带较夜温为24 ℃的处理少了D位点的谱带，较夜温为12 ℃的处理少了D、E位点的谱带；但多了B位点的谱带。此外，在C位点，夜温为 18 ℃的处理 T4谱带较其他两个温度处理明显存在量上的差异。因材料遗失，缺失了对照 First的花药谱带。对照的叶片蛋白质谱带没有什么差异，仅C位点上表现出量上的稍微差异。而不同温度处理的T4叶片蛋白质谱带间存在差异，夜温为18 ℃的处理较其他两个温度处理少了I位点的谱带。说明不同器官蛋白质存在差异，即使在同一器官，不同的处理也会存在差异。T4在可育和不育条件下，不仅在花粉发芽率和自交结实率上存在差异，在蛋白质表达上也存在差异。

表2 差异蛋白质的相对迁移率及其蛋白质分子量

3 结论与讨论

本试验主要从夜温不同的角度剖析番茄T4育性的临界温度，试验结果表明夜温的临界温度在18 ℃左右。夜温为12 ℃与24 ℃时，T4的花粉发芽率、自交结实率及果实种子数均不存在显著性差异，但与对照First之间存在极显著性差异，此时T4表现为雄性不育，可用于制种。当夜温为18 ℃时，T4的花粉发芽率、自交结实率及果实种子数与对照差异不显著，此时T4恢复部分育性。表明番茄T4不育表现受夜温影响，但在夜温12 ℃和24 ℃下的T4表现出来的不育机理还有待于进一步研究。

对番茄蛋白质方面的研究尚鲜见报道，武晗等（2009）对几种小麦雄性不育系育性敏感时期的蛋白质含量变化进行了研究，结果表明旗叶小穗发育的单核期和二核期均为育性发育的敏感时期，该时期可以检测到特异蛋白的存在，说明该特异蛋白极有可能是与育性相关的或者育性发育所必须的。

本试验电泳结果显示，番茄核雄性不育系T4的叶片蛋白质和花药蛋白质谱带与对照都存在差异，该结论与曾维英等（2008）得到大豆雄性不育系与保持系花药 2-DE图谱间存在较多差异蛋白点、种子间仅有少量差异表达蛋白点、而叶片间基本上没有差异表达蛋白点存在不同，有待于进一步验证。

陈丽，谭丽丽，王勇.2009.番茄温敏型功能雄性不育生理机制的初步研究.东北农业大学学报，40（1）：31-35.

陈蕊红，叶景秀，张改生，王俊生，牛娜，马守才，赵继新，朱建楚.2009.小麦质核互作型雄性不育系及其保持系花药差异蛋白质组学分析.生物化学与生物物理进展，36（4）：431-440.

傅鸿仪.1983.高粱线粒体基因组的翻译产物与细胞质雄性不育性.遗传学报，10（6）：471-476.

胡天桥.2009.肺结核患者血清小分子标志蛋白分离鉴定的初步研究〔硕士论文〕.广西：广西医科大学.

藤晓月，陈雪晖.1996.小麦T型细胞质雄性不育系和保持系蛋白质的比较研究.作物学报，22（3）：264-270.

武晗，马翎健，何蓓如，李薇，靳凤，王爱芳.2009.几类小麦雄性不育系育性敏感时期蛋白质含量的变化.西北农业学报，18（3）：94-96.

曾维英，杨守萍，喻德跃，盖钧镒.2008.大豆雄性不育系与其保持系不同器官蛋白质比较.西北植物学报，28（8）：1619-1624.

Masaharu M，Ojiewo C O.2006.Induced mutagensis as a breeding strategy for improvement of solanaceous vegetables.Gamma Field Symposia，45：47-59.

Peet M M，Batholomew M.1996.Effect of night temperature on pollen characteristics，growth and fruitset in tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）.Journal of the American Society for Horticulture Science，121：514-519.

Pressman E，Peet M M，Pharr D M M.2002.The effect of heat stress on tomato pollen characteristics is associated with changes in carbohydrate concentration in the developing anthers.Annals of Botany，90（5）：631-636.

Sheoran I S，Ross A R S，Olson D J H，Sawhney V K.2009.Differential expression of proteins in the wild type and 7B-1 male-sterile mutant anthers of tomato（Solanum lycopericum）：a proteomic analysis.Journal of Proteomics，71：624-636.

Singh S，Sawhney V K.1998.Abscisic acid in a male sterile tomato mutant and its regulation by low temperature.J Exp Bot，49：199-203.

Zhang M F，Chen L P，Yutaka H，Cao J S，Chen Z J.2001.Rapid detection of specific proteins expressed in cytoplasmic male-sterile line of tuber mustard using SDS-PAGE.Journal of Zhejiang University Agriculture and Life Science，27（6）：646-648.