硝酸钙对嫁接网纹甜瓜果实糖含量及糖代谢相关酶活性的影响

李天来 李骥尧 刘轶飞，2

（1沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室，辽宁省设施园艺重点实验室，辽宁 沈阳 110866；2沈阳农业大学土地与环境学院，农业部东北土壤与环境重点开放实验室，辽宁省农业资源与环境重点实验室，辽宁 沈阳 100866）

甜瓜（Cucumis melon L.）被誉为世界十大水果之一，在国内外栽培历史悠久，是近些年发展较快、经济价值较高的一种作物。厚皮甜瓜嫁接栽培是克服土壤次生盐渍化、连作障碍、低温、弱光等环境伤害和防治土传病害的重要措施之一。但生产实践和许多研究证实，嫁接往往导致甜瓜品质下降，尤其是嫁接甜瓜果实含糖量明显降低（许传强和李天来，2005），而含糖量是衡量厚皮甜瓜品质的重要指标之一（Yamaguchi et al.，1977）。因此探讨厚皮甜瓜果实糖代谢的调控措施对于改善嫁接厚皮甜瓜果实品质具有重要意义。

前人在苹果和柑橘等作物研究（梁和 等，2002；耿增超 等，2004）中已证实，产品器官生长发育期合理施用钙肥，可以提高果实产量和品质，调节以蔗糖为转运糖的植株糖代谢相关酶活性，提高含糖量，甚至在逆境胁迫条件下也能缓解果实品质下降（李彦 等，2003）。还有报道指出，适量的氮肥可以提高果实中可溶性糖含量及糖酸比，但过量施用氮肥不利于产量的提高和糖分的积累（赵智中 等，2001；姜东 等，2002；齐红岩 等，2005）。然而，有关以水苏糖为主要转运糖的植物果实糖含量和糖代谢相关酶活性的钙素调控研究甚少，目前更没有在生产上应用。

为此，本试验研究了不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实棉籽糖系列寡糖代谢的影响，旨在为进一步应用硝酸钙改善嫁接厚皮甜瓜品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2009年2～7月在沈阳农业大学工厂化高效农业工程技术研究中心试验基地进行。供试材料为自根网纹甜瓜（Cucumis melon L.var.reticulatus Naud.）品种中蜜1号和以白籽南瓜圣砧1号为砧木、以中蜜1号为接穗的嫁接厚皮甜瓜。2月20日播种网纹甜瓜中蜜1号，3月1日播种白籽南瓜圣砧 1号。待接穗长到二叶一心时与砧木进行靠接，而后定植于日光温室栽培桶中，桶高30 cm，直径30 cm，桶内装腐熟好的基质（土∶草炭∶鸡粪=3 V∶2 V∶1 V），桶底铺2 cm厚的珍珠岩，株距60 cm，行距80 cm。每桶栽种1株，定量浇水，统一施肥，以确保水肥一致；栽培过程中采用吊蔓单干整枝方式，在主干第12节位留瓜，第21节位去生长点，每株选留1瓜，雌花开放当日上午进行人工授粉，并挂牌标记花期。花后5 d开始向叶面喷施不同浓度硝酸钙，利用带有刻度的2 L小型喷雾器进行叶面喷施，每株喷施50 mL硝酸钙溶液，每隔7 d喷1次，共喷6次，以喷施蒸馏水的嫁接植株为对照1（CK1），以喷施蒸馏水的自根植株为对照2（CK2），以外源喷施不同浓度的硝酸钙植株为处理，浓度分别为0.2 %（C1）、0.5 %（C2）、0.8 %（C3），每株取样1次，3次重复，每隔7 d取果实中果肉用于糖含量及糖代谢相关酶测定，取样时间为上午9：00。

1.2 项目测定

1.2.1 可溶性糖含量 依据Madore（1990）和Miao等（2007）的方法并加以改进。将5 g样品置于试管中，用80 %乙醇提取，80 ℃水浴1 h，反复提取3次，合并提取液，过C18小柱滤除色素，蒸干，1 mL超纯水溶解，上清液经0.45 μm滤膜过滤后进液相（HPLC）测定。测定方法及色谱条件为：Waters 600E高效液相色谱，柱子为 Luna 5U NH2100R column（Phenomenex Separation Products，USA），柱温35 ℃，2410示差检测器，流动相比例为70 %乙腈和30 %超纯水，流速为 1.4 mL·min-1。糖标样（SIGMA-ALDRICH Co.，3050 Spruce Spruce Street，St.Louis，Mo63103 USA）为果糖（Product No.31140）、葡萄糖（Product No.G5400）、蔗糖（Product No.84099）、棉籽糖（Product No.R0250）、肌醇半乳糖苷（Product No.79544）、水苏糖（Product No.S4001），他们的色谱保留时间分别为 4.468、5.225、6.324、12.007、13.196、21.901 min。并用 Waters Millennium软件对分离图谱进行控制及数据处理。本试验中的总糖含量指的是以上几种糖含量的总和。

1.2.2 淀粉含量 采用高氯酸水解法（牛森，1992）测定。

1.2.3 糖代谢相关酶活性

1.2.3.1 酶的提取 取 1 g冷冻样品，加少量石英砂和 10 mL Hepes缓冲液（50 μmol·L-1Hepes-NAOH，pH 7.5，1 μmol·L-1MgCl2，2.5 μmol·L-1DTT，10 μmol·L-1VC 和 5 %不溶性的PVPP），冰浴研磨成匀浆，4层纱布过滤，4 ℃条件下12000 g离心20 min，去上清液，留沉淀，用提取缓冲液2～5 mL溶解沉淀，再用稀释10倍的提取缓冲液（不含PVPP）透析20 h。以上所有操作在0～4 ℃条件下进行。

1.2.3.2 酸性转化酶、中性转化酶活性测定 0.8 mL反应液（pH 4.8或 pH 7.2的 0.1 mol·L-1Na2HPO4，0.1 mol·L-1柠檬酸钠，0.1 mol·L-1蔗糖）中加入 0.2 mL 酶液，37 ℃条件下反应 30 min，用3，5-二硝基水杨酸法测定生成的还原糖含量，酶活性单位为μmol·h-1·g-1（FW）。

1.2.3.3 蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性测定 参照於新建（1985）的方法进行测定，酶的活性单位为μmol·h-1·g-1（FW）。本试验中测定的SS活性为合成方向。

1.2.3.4 碱性α-半乳糖苷酶的提取和测定 参照杜永臣（1998）的方法并加以改进。

试验中的UDPG、6-磷酸果糖等生化试剂均购自美国Sigma公司。

采用Excel 2007和DPS分析软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实可溶性糖、总糖和淀粉含量的影响

2.1.1 对可溶性糖含量的影响 从图1可以看出，嫁接厚皮甜瓜显著降低了果实中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，但提高了棉籽糖和水苏糖含量。从果实不同发育期含糖量来看，果糖、葡萄糖含量随果实发育不断升高，处理35 d时达到峰值，随后有所下降，而蔗糖含量则直到果实成熟还在不断升高，果糖、葡萄糖和蔗糖含量最高分别达到25.62、23.44、26.35 mg·g-1；棉籽糖和水苏糖含量则呈现下降趋势，肌醇半乳糖含量的变化趋势为先升高再降低，而且肌醇半乳糖、棉籽糖和水苏糖含量较低，尤其是棉籽糖含量，最高仅为0.42 mg·g-1。从不同处理对厚皮甜瓜果实中各种糖含量的影响来看，不同浓度硝酸钙处理均在一定程度上提高了嫁接厚皮甜瓜果实果糖、葡萄糖和蔗糖含量，降低了棉和水苏糖含量；与CK1相比，从处理后21 d开始，C2和C3处理显著提高了果糖、葡萄糖和蔗糖含量，且在处理后14～21 d显著提高了肌醇半乳糖的含量，而自处理后14 d开始不同浓度硝酸钙处理均降低了棉籽糖和水苏糖含量，其中C2处理的影响最大，C3处理次之，C1处理最弱；与CK2相比，C2处理并没有使果糖、葡萄糖和蔗糖含量恢复到自根厚皮甜瓜水平，但C2处理的果实棉籽糖和水苏糖含量与CK2差异不显著。

图1 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实中果糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇半乳糖、

2.1.2 对总糖和淀粉含量的影响 如图2所示，不同浓度硝酸钙处理并没有改变果实中总糖含量的变化趋势，随着果实的不断成熟，总糖含量在处理后7～35 d呈现逐渐上升的趋势，于35 d达到最大值。与CK1相比，不同浓度硝酸钙处理均明显增加了果实中总糖含量，在处理后21～42 d，C2处理显著提高了总糖含量，C1、C3处理次之；与CK2相比，在处理后21～35 d，C2处理的总糖含量仍然显著低于自根对照CK2，但果实成熟时（处理后42 d）总糖含量接近于自根对照。

随着厚皮甜瓜果实发育，无论是处理还是对照，淀粉含量都呈现逐渐升高的趋势，到处理后 35 d达到最大值，随后有所降低。与CK1和CK2相比，C2和C3处理均显著或极显著的增加了处理后35～42 d厚皮甜瓜果实淀粉含量。

图2 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实中总糖和淀粉含量的影响

2.2 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实糖代谢相关酶活性的影响

2.2.1 对转化酶活性的影响 如图 3所示，无论是酸性转化酶还是中性转化酶均在果实发育初期呈现较高水平，之后其活性不断降低。从不同浓度硝酸钙处理对酸性转化酶活性的影响来看，与CK1相比，处理后14～35 d，C2处理极显著增加了酸性转化酶活性，但与CK2差异不显著；从不同浓度硝酸钙处理对中性转化酶活性的影响来看，不同浓度硝酸钙处理与CK1相比均无显著差异，但却与 CK2差异显著，说明硝酸钙处理对于中性转化酶活性影响较弱。

图3 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实中酸性转化酶和中性转化酶活性的影响

2.2.2 对蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和碱性α-半乳糖苷酶活性的影响 从图4可以看出，不同浓度硝酸钙处理并没有改变蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和碱性α- 半乳糖苷酶活性的变化规律。随着果实发育，蔗糖合成酶的活性呈先降低后升高的趋势，从不同浓度硝酸钙处理对厚皮甜瓜蔗糖合成酶活性的影响来看，与 CK1相比，不同浓度硝酸钙处理对蔗糖合成酶活性影响不显著，但却显著低于CK2。蔗糖磷酸合成酶活性随着果实的膨大而增加，从不同处理对于该酶活性的影响来看，与 CK1相比，处理后28～42 d，不同浓度硝酸钙处理均显著增加了蔗糖磷酸合成酶活性，其中 C2处理与CK1差异极显著，却与CK2无显著差异，说明不同浓度硝酸钙处理对蔗糖合成酶活性的影响较弱，而对蔗糖磷酸合成酶活性的影响较强。

在果实膨大前期，不同浓度硝酸钙处理的碱性α-半乳糖苷酶均具有较高的活性，但随着果实的发育其活性开始降低，尤其在处理后21～28 d碱性α-半乳糖苷酶活性下降幅度较大。从不同处理对该酶活性的影响来看，与CK1和CK2相比，在处理后14～28 d，不同浓度硝酸钙处理均显著或极显著的增加了碱性α-半乳糖苷酶活性，其余时期差异不显著，而且处理间差异也不显著。

图4 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实中蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和碱性α-半乳糖苷酶活性的影响

3 讨论

3.1 嫁接厚皮甜瓜果实中多种可溶性糖及糖代谢相关酶活性对不同浓度硝酸钙处理的响应

已有研究表明，一定浓度的钙处理可以增加厚皮甜瓜果实中总糖含量和淀粉含量（吕双双，2009）；同时，氮素营养也与糖的积累及代谢存在一定联系，李远新等（1997）、彭福田等（2002）研究表明，随着氮素施用量的增加，苹果和番茄果实还原糖含量提高；姜东等（2002）的试验表明，在一定范围内提高施氮量可提高小麦蔗糖磷酸合成酶活性，促进光合碳同化产物向蔗糖的转化，促进蔗糖合成；但施氮过多则会使果实含糖量下降（赵智中 等，2003）。本试验研究了 3种不同浓度硝酸钙对厚皮甜瓜果实中棉籽糖类寡糖含量的影响，结果表明：硝酸钙对糖含量及其代谢相关酶均有重要的调控作用，与CK1相比，在整个果实发育过程中，0.5 %硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实含糖量的影响最大，显著提高了果糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇半乳糖、总糖和淀粉含量，并且显著或极显著提高了酸性转化酶、蔗糖磷酸合成酶和碱性α- 半乳糖苷酶活性，促进了以棉籽糖和水苏糖为主要转运形式的光合产物向蔗糖进而向单糖方向的转化，使成熟果实中总糖含量和淀粉含量增加，0.8 %硝酸钙处理提高嫁接厚皮甜瓜果实含糖量的程度不及0.5 %硝酸钙处理，这可能是由于氮水平过高，超出了正调控的范围，从而使硝酸钙的调控效果减弱。因此，本试验条件下，0.5 %硝酸钙溶液为最佳处理浓度。

3.2 硝酸钙处理条件下嫁接厚皮甜瓜果实糖代谢相关酶活性与可溶性糖含量的关系

探讨嫁接厚皮甜瓜果实糖代谢相关酶活性与果实中多种可溶性糖含量关系对于进一步深入研究硝酸钙处理后糖代谢的作用机制是至关重要的。根据前人对葫芦科作物碳水化合物的代谢路径的研究发现，蔗糖代谢对于最终碳水化合物积累贡献较大，蔗糖代谢相关酶起着很大的作用（Gao et al.，1999；Dai et al.，2006；Liu et al.，2010）。同时，另外一个关键因素也不容忽视：作为果实棉籽糖类寡糖的起始酶，碱性α-半乳糖苷酶也具有同等重要的作用，报道发现碱性α-半乳糖苷酶主要负责催化棉籽糖和水苏糖水解，这对于葫芦科作物碳水化合物分配和大量转运糖小分子化过程有着重大的贡献（Tian et al.，2009；Liu et al.，2010）。本试验发现在果实发育前中期，硝酸钙处理提高了酸性转化酶活性，这为早期厚皮甜瓜果实合成葡萄糖和果糖提供了有利条件。这与前人在蜜桔上的研究结果相似（赵智中 等，2001）。在果实发育后期，硝酸钙处理的蔗糖磷酸合成酶升高较快，同时转化酶活性较低，此时有利于蔗糖的大量积累。以往的研究表明，碱性α- 半乳糖苷酶的活性随着植物的生长发育而改变，在南瓜和黄瓜生长前期叶片中的碱性α- 半乳糖苷酶的活性较高，但是随着库活力的减弱，其活性减弱（Gaudreault &Webb，1982），这与本试验中碱性α- 半乳糖苷酶活性的变化趋势相同。在本试验中，处理后7～28 d碱性α-半乳糖苷酶的活性较高，这为大量蔗糖及半乳糖的生产提供了保障，有利于向快速膨大的果实提供葡萄糖和果糖。在研究糖积累机理时，应考虑蔗糖代谢相关酶的综合作用，酶的净活性是反映这种综合作用的指标（凌霄 等，2005）。可见，硝酸钙处理后果实中糖的积累主要受果实内部蔗糖代谢酶的种类和活性大小影响。

3.3 不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜果实品质的影响

果实积累糖的种类、含量和比率是决定果实风味品质和商品价值的重要因子。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果实中主要的可溶性糖，其含量和组成对果实品质起着重要作用，因此碳水化合物的代谢及其变化与果实品质形成密切相关。0.5 %硝酸钙处理对甜瓜果实中蔗糖代谢和水苏糖代谢影响显著。各种糖含量明显上升，尤其是葡萄糖、果糖和蔗糖，但其调控程度仍然没有达到自根对照水平。根据甜味指数绝对值公式（马克奇）：甜味指数=蔗糖×100+果糖×173.3＋葡萄糖×74.3，计算得出0.5 %硝酸钙处理后厚皮甜瓜果实、嫁接对照果实及自根对照果实的甜味指数绝对值分别为7760.23、6492.31、8762.14，0.5 %硝酸钙处理较嫁接对照果实上升了19.53 %。但是甜度仍然弱于自根对照果实，同时，硝酸钙处理促进可溶性糖向淀粉方向的合成，使淀粉含量大幅度升高，这在一定程度上降低了果实的甜味，对果实品质造成了一定负面影响。因此，如何调控淀粉向蔗糖方向转化成为今后改善嫁接厚皮甜瓜品质的关键。

4 结论

与嫁接对照相比，不同浓度硝酸钙处理均不同程度提高了嫁接厚皮甜瓜果实淀粉、总糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量及其果实发育前中期的酸性转化酶、碱性α- 半乳糖苷酶和果实发育中后期的蔗糖磷酸合成酶等糖代谢相关酶活性，其中0.5 %硝酸钙处理效果最佳，增加了果实发育中后期蔗糖含量，具有改善嫁接厚皮甜瓜果实品质的作用。但因0.5 %硝酸钙处理的嫁接厚皮甜瓜果实品质仍未能恢复到自根对照水平，因此欲使嫁接厚皮甜瓜果实品质恢复到自根水平还需进一步研究。

杜永臣.1998.高温对黄瓜根系可溶性糖含量和α- 半乳糖苷酶活性的影响//侯喜林，常有宏.园艺学进展.2辑.南京：东南大学出版社：448-451.

耿增超，张立新，张朝阳.2004.渭北旱地叶面施钙对红富士苹果产量和品质的影响.西北林学院学报，19（2）：35-37.

姜东，于振文，李永庚，余松烈.2002.施氮水平对高产小麦蔗糖含量和光合产物分配及籽粒淀粉积累的影响.中国农业科学，35（2）：157-162.

李彦，高贤彪，卢丽萍，杨果，崔荣宗.2003.高盐分土壤中钙硒对黄瓜产量与品质影响的研究.山东农业科学，3（1）：34-35.

李远新，李进辉，何莉莉.1997.氮磷钾肥配施对保护地番茄产量及品质的影响.中国蔬菜，（4）：10-13.

梁和，马国瑞，石伟勇，杨玉爱.2002.硼钙营养对不同品种柑桔糖代谢的影响.土壤通报，33（5）：377-380.

凌霄，沈法富，卢合全，韩庆点，刘云国.2005.蔗糖代谢中蔗糖磷酸合成酶的研究进展.分子植物育种，3（2）：275-281.

吕双双.2009.钙调控乙烯诱导网纹甜瓜果实软化效果及其作用机制研究〔博士论文〕.沈阳：沈阳农业大学.

牛森.1992.作物品质分析.北京：中国农业出版社：46.

彭福田，姜远茂，顾曼如.2002.不同负荷水平下氮素对苹果果实生长发育的影响.中国农业科学，35（6）：690-694.

齐红岩，李天来，周旋.2005.不同氮钾水平对番茄产量、品质及蔗糖代谢的影响.中国农学通报，11（21）：251-255.

许传强，李天来.2005.嫁接对网纹甜瓜生长发育、产量及品质的影响.中国蔬菜，（6）：12-14.

於新建.1985.植物生理学实验手册.上海：上海科学技术出版社.

赵智中，张上隆，刘拴桃.2003.高氮处理对温州蜜柑果实糖积累的影响.核农学报，17（2）：119-122.

赵智中，张上隆，徐昌杰，陈昆松，刘拴桃.2001.蔗糖代谢相关酶在温州蜜柑果实糖代谢中的作用.园艺学报，28（2）：112-118.

Dai N，Petreikov M，Portnoy V，Katzir N，Pharr D M，Schaffer A A.2006.Cloning and expression analysis of a UDP-Galactose/Glucose pyrophosphorylase from melon fruit provides evidence for the major metabolic pathway of galactose metabolism in raffinose oligosaccharide metabolizing plants.Plant Physiology，142：294-304.

Gao Z F，Arthur A S.1999.A novel alkalineα-galactosidase from melon fruit with a substrate preference for raffinose.Plant Physiology，119：979-987.

Gaudreault P R，Webb J A.1982.Alkaline α-galactosidase in leaves of Cucurbita pepo.Plant Science Letters，24（3）：281-288.

Liu Y F，Li T L，Qi H Y，Qi M F，Chen W Z，Xu C Q，Li J Y.2010.Effects on carbohydrate and amino acids accumulation in muskmelon fruit（Cucumis melo L.）with different grafting rootstocks.Acta Horticulturae，871：579-588.

Madore M A.1990.Carbohydrate metabolism in photosynthetic and nonphotosynthetic tissues of variegated leaves of Coleus blumei Benth.Plant Physiology，93：617-622.

Miao M M，Xu X H，Chen L B，Xue B S.2007.Cucumber carbohydrate metabolism and translocation under chilling.Journal of Plant Physiology，164：621-628.

Tian H M，Kong Q G，Feng Y Q，Yu X Y.2009.Cloning and characterization of a soluble acid invertase encoding gene from muskmelon.Molecular Biology Reports，36：611-617.

Yamaguchi M，Hughes D，Yabumoto K.1977.Quality of cantaloupe muskmelons：quality and attributes.Scientia Horticulturae，6：59-70.