黑龙江省依兰县酸浆根腐病病原菌鉴定及生物学特性初步研究

王 勇 张晶晶 叶阳阳 陈 典

（东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

酸浆（Physalis alkekengi L.）是茄科酸浆属多年生宿根草本植物，地下根状茎横生，成熟浆果橙红色或黄色，可供鲜食和观赏（葛玉 等，2006）。在热带和亚热带地区，酸浆作为一种常用药物被广泛用于治疗疟疾、哮喘、肝炎、皮炎、风湿等疾病（甄清 等，2006），另外酸浆中的酸浆苦素还具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌、强心等生物活性（许亮 等，2009）。

在酸浆大面积生产种植中，多采用一次播种连续4～5 a采收的方法（孙伟 等，2008），其根状茎容易发生多种病害。本试验以黑龙江省依兰县感病红果酸浆〔Physalis alkekengi L.var francheti（Mast.）Makino〕的病根和地下茎为试材进行病原菌分离和鉴定，同时对致病菌的生物学特性进行了研究，旨在探讨酸浆根腐病的发生发展规律，为制定综合防治措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌的鉴定

1.1.1 病样采集及病原物分离培养 2008年4月～2010年10月在黑龙江省依兰县酸浆种植地多点采集病根及地下茎，采用组织分离法分离病原菌（方中达，1998），病样组织接种于 PDA培养基，25 ℃恒温培养（PDA中含终浓度为100 mg·L-1的链霉素以抑制细菌生长）。纯化培养物，转入冻存管中，4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 致病性测定 将分离得到的优势菌落在PDA平板上于25 ℃、24 h光照条件下培养5 d，采用伤口接种法，将直径为8 mm的菌碟直接接种于苗龄为20～25 d的酸浆幼苗地上茎部位，每种菌接种30株。接种后幼苗于温室中培养，以不接菌的植株为对照。

根腐病病情分级标准：0级：无症状；1级：须根变黑；2级：主根及地下茎变黑；3级：主根及地下茎变黑腐烂，地上部生长不良；4级：根部腐烂，植株死亡。

1.1.3 病原菌形态观察 将分离出的优势菌株接种到PDA平板上，25 ℃培养箱中光照培养5 d，肉眼观察菌落形态特征，在光学显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗形态。根据病原菌产孢特征及其在PDA培养基上的形态特征，对病原菌进行初步鉴定。

1.1.4 病原菌产孢特征观察 在SNA平板上接种直径为8 mm的病原菌菌碟，25 ℃光照培养箱中培养4 d，于滴有无菌水的载玻片上挑取少量菌丝，在光学显微镜下观察产孢情况。

1.1.5 病原菌 rDNA ITS扩增及序列分析 将酸浆根腐病致病菌接在 PDA培养基表面的玻璃纸上，25 ℃恒温培养5 d，取0.1 g菌丝体，加入液氮研磨，用改良的CTAB法提取病原菌基因组总 DNA（陈昆松 等，2004）。rDNA ITS扩增采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，包括：10×PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 1 μL，DNA 模板 100 mg，10 μmol·L-1ITS1 和 ITS4各1 μL，5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O补足。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳检测，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

测序结果经 BLAST（http：//www.ncb.inlm.nih.gov/blast）与 NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，结合病原菌的形态学特征及致病性测定，确定酸浆根腐病的主要致病菌。

1.2 病原菌的生物学特性研究

将致病菌的菌株移到PDA平板上培养3～4 d后进行以下试验。

1.2.1 不同温度对菌落生长的影响 从上述培养的菌株菌落边缘，用打孔器取直径为8 mm的菌碟，接到PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒温箱中培养，第5天用十字法测量菌落生长直径，取平均值，每处理3次重复，并记录菌落形态、颜色变化等。

1.2.2 不同pH值对菌落生长的影响 用HCl缓冲液和NaOH缓冲液将PDA培养基pH值调成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.06个梯度，然后将培养基灭菌。将直径为8 mm的菌碟接到不同pH值的PDA平板上，25 ℃恒温培养箱中培养5 d，观察方法同1.2.1。

1.2.3 不同光照对菌落生长的影响 设置3种不同光照条件的培养箱，即24 h全光照、24 h全黑暗、12 h光照与12 h黑暗交替3种处理，培养温度及观察方法同1.2.2。

1.3 数据处理

数据计算借助于Excel软件完成，百分数经反正弦平方根转换后用SAS 6.0软件进行方差分析。采用Clustalx和TreeView32软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 田间病害症状

受病原菌侵害的酸浆植株矮小，长势弱。发病初期，地下须根感病，变少，新生的根也很稀疏，植株基部叶片由叶尖开始变黄，并逐渐向上部叶片发展。后期主根及根茎上可见黑褐色病斑，出现腐烂至病部组织变硬，裂口深及木质部。直接导致水分与营养物质中断，最后导致整株萎蔫死亡（图1）。

2.2 致病性测定

以酸浆感病根及地下茎为材料，进行病原菌分离。从病变组织中共分离出7种菌株，其中3号菌株与6号菌株为广谱性青霉菌，其他均为镰孢菌属病原菌。为了确定主要致病菌，首先将分离出的各病原菌在PDA培养基上培养5 d，打成直径为8 mm的菌碟进行伤口接种，定期观察。7号菌株和4号菌株在接种9 d后，接种部位出现黑色斑点，后期植株根部出现水渍状病斑，逐渐腐烂，地上部叶片变黄并逐渐萎蔫，与健康植株比较长势弱（图2）。1号菌株和2号菌株在接种13 d后也有症状出现，但较轻微，而5号菌株接种后没有发病。从各致病菌回接后酸浆的发病率和病情指数可以看出（表 1），7号菌株与4号菌株为主要致病菌，将其分别命名为PHADDR07和PHADDR04。

图1 酸浆根腐病危害症状

图2 接种PHADDR07菌株和PHADDR04菌株后酸浆植株与健康植株地下部比较

从病重组织重新分离病原物，经分离纯化获得的病原菌与原接种病原菌在菌落、分生孢子等形态特征上完全一致。根据致病性测定结果及病原菌形态特征观察（Booth，1988），初步鉴定酸浆根腐病主要致病菌为茄镰孢菌〔Fusarium solani（Mart.）Sacc.，PHADDR07〕和尖镰孢菌（Fusarium oxysporum Schlecht.，PHADDR04）。

表1 各分离病原菌回接后酸浆的发病率和病情指数

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 病原菌的形态特征 PHADDR07菌株在PDA培养基上25 ℃恒温培养5 d，菌落直径为55～62 mm，菌落边缘平滑，近圆形，气生菌丝绵绒状，白色至肉色，间有土黄色，培养基不变色。小型分生孢子呈卵形、洋梨形或肾形，散生，无隔或有隔；大型分生孢子为马特形，3～5分隔，两端较钝圆，在菌丝顶端单生或散生。气生菌丝上的分生孢子梗为长筒形的单瓶梗（图3）。

图3 PHADDR07菌株孢子形态（40×）

PHADDR04菌株在PDA培养基上25 ℃恒温培养5 d，菌落直径为58～70 mm，菌落呈圆形，淡粉色或洋红色，菌落边缘菌丝呈乳白色，培养基不变色。大型分生孢子呈美丽形，两端渐尖，足细胞较明显，多为2～4分隔；小型分生孢子呈卵形、椭圆形或肾形，假头生，0～1分隔。分生孢子梗为单瓶梗，较短，单生或具分枝（图4）。

2.3.2 致病菌的分子鉴定 以PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，两个菌株都扩增出500～600 bp大小的片段（图5），测序后显示 PHADDR04菌株的扩增片段为 504 bp，PHADDR07菌株的扩增片段为529 bp。将所得序列于NCBI的数据库中进行BLAST分析，结果显示：PHADDR07菌株的 rDNA ITS序列与F.solani的同源性达到99 %以上，而PHADDR04菌株的rDNA ITS序列与F.oxysporum的同源性达到 100 %。聚类分析结果表明（图 6），PHADDR07菌株和PHADDR04菌株的ITS序列都与生姜（GQ121300，GQ121304）根腐病病原菌的亲缘关系最为密切，说明二者可能具有相似的寄主范围。

结合形态学观察、致病性测定与 rDNA ITS序列分析，可以确定酸浆根腐病主要致病菌为茄镰孢菌（F.solani）与尖镰孢菌（F.oxysporum）。

图5 PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的rDNA ITS序列扩增结果

图6 PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的rDNA ITS序列聚类图

2.4 病原菌生物学特性

2.4.1 温度对菌落生长的影响 温度对菌落生长有明显的影响，PHADDR04菌株在10～30 ℃均能生长，25 ℃时长势最优，显著优于其他温度，在低于10 ℃或高于40 ℃的条件下菌丝停止生长；PHADDR07菌株在10～35 ℃均能扩展，25～30 ℃为最适温度域，低于10 ℃或高于38 ℃时停止生长。

2.4.2 pH值对菌落生长的影响 pH值对菌落生长有一定的影响，PHADDR04菌株与PHADDR07菌株在pH值为5.0～10.0之间均可生长，但菌落大小在最适pH值与非最适pH值下存在显著差异。尖镰孢菌的最适pH值为7.0，菌落直径可达62 mm；而8.0是茄镰孢菌的最适pH值，菌落直径为54 mm。

2.4.3 光照对菌落生长的影响 在相同温度与pH值的条件下，设置全光、全暗、12 h光暗交替3种不同光照处理，观察其对菌落生长的影响。光暗交替处理PHADDR04菌株与PHADDR07菌株的生长都较全光和全暗处理快，但差异不显著，说明光照不是影响尖镰孢菌与茄镰孢菌生长的主要因素。

3 结论与讨论

本试验通过病原菌的形态学观察、致病性测定和rDNA ITS序列分析，最终确定酸浆根腐病的主要致病菌为尖镰孢菌（F.oxysporum）和茄镰孢菌（F.solani）。尖镰孢菌和茄镰孢菌是分布广泛的土壤习居菌，侵染能力很强，二者既可单独侵染植物，也可共同侵染导致植物发病。周洪友等（2004）报道，茄镰孢菌和尖镰孢菌共同作用导致沙打旺根腐病发生；而辣椒根腐病（刘丽云 等，2007）、甜瓜根腐病（杨来新 等，2004）、西瓜根腐病（耿丽华 等，2010）均由茄镰孢菌侵染所致；尖镰孢菌侵染可导致马铃薯根腐病的发生（Manici & Caputo，2009）。

本试验对酸浆根腐病的两种主要致病菌进行了生物学特性的初步研究，结果表明：光照对两种主要致病菌的生长影响不大，尖镰孢菌的最适生长温度为25 ℃，致死温度为40 ℃，在pH值为7.0的PDA培养基上生长良好；茄镰孢菌在pH值为8.0、温度域为25～30 ℃条件下长势最优，致死温度为38 ℃。

本试验确定了酸浆主产区黑龙江省依兰县根腐病的主要致病菌，并就其生物学特性进行了初步研究，对于生产上根腐病防治具有一定的指导意义。但茄镰孢菌和尖镰孢菌是否存在酸浆专化型，其产孢特性如何以及孢子萌发的条件等还有待于进一步研究。

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