氯化铝对人精子毒性作用及美洛昔康对其干预作用的体外试验研究Δ

汤召兵，苟 欣，王 明，何卫阳，刘朝东，邓远忠，李 杰，陈 勇，任 轲（重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆市 400016）

铝在环境中大量存在，故人的一生中暴露于铝是不可避免的。在日常生活中，铝经过饮水、食物等被人体吸收，尤其对于特殊人群如铝从业者、长期使用含铝的药物及化妆品者，则增加了其铝的摄入量。铝在体内聚积可引起人类多种疾病，如透析性痴呆、老年性痴呆、非缺铁性小红细胞性贫血、软骨病等[1]。研究[2]发现，氯化铝（AlCl3）对动物具有胚胎毒性，可致畸胎形成。食入过多的铝可使其在靶器官内聚积，对人及动物的睾丸组织均有损害作用。精子的存活率和活动率都与体内精子及精浆中含铝的浓度相关，铝的浓度越高，精子存活率和活动率越低。但在体外试验中，有关铝的生殖毒性的研究文献报道还较少，Yousef等[3]证实在体外，铝同样具有生殖毒性作用。美洛昔康为新一代非甾体类抗炎药，具有显著而持久的抗炎作用及一定的止痛、解热作用，安全性、耐受性好，已在临床广泛使用。美洛昔康在临床上使用的常规剂量为每日15 mg，其副作用较少，主要表现为胃肠道反应，也有少数出现过敏反应。有研究[4]证实，美洛昔康对铝所致的神经系统损害也具有显著的保护作用。本文通过体外试验研究AlCl3对人精子的毒性作用及美洛昔康对其的干预作用，以期为临床应用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

WLJY-2008型电脑自动精液采集分析仪（北京伟力新世纪科技发展有限公司）；CX21显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

美洛昔康片（昆山龙灯瑞迪制药有限公司，批号:070502，规格:每片15 mg）；六水三氯化铝（AlCl3·6H2O）（大连雪源精细化工有限公司，国产分析纯）；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司）。

1.3 精液

收集健康男性（年龄25～35岁）精液标本，经分析各项指标均符合世界卫生组织（WHO）相关标准，其中精液量≥3 mL，精子浓度≥50×106个/mL，活动率≥70%，共收集精液标本5份。

2 方法

2.1 溶液的制备

取AlCl3·6H2O，加蒸馏水稀释制成浓度分别为5、10、15 mol·L－1的AlCl3溶液。另取美洛昔康片，精密称定，碾磨成粉，加蒸馏水稀释制成浓度为1×10－5mol·L－1的美洛昔康溶液。

2.2 分组处理

精液标本放置于37℃水浴箱中，液化后，每份精液作如下处理:用精子营养液将精液稀释至1×106个/mL，调节pH为7，然后均分为8份，4份为1组，每组4个亚组，第1组为对照组（生理盐水）和AlCl3低、中、高剂量组（5、10、15 mol·L－1），每组加入相应药物；第2组在第1组的基础上，除对照组改为加入美洛昔康1×10－5mol·L－1外，其余3组均预先加入美洛昔康1×10－5mol·L－1。

2.3 精子存活率与活动率的检测

以加入AlCl3后开始计时，在37℃水浴箱中培育0、2、4 h后检测精子的存活率及活动率。用0.5%伊红染色，光镜下观察着色的为死精子，未着色的为活精子，存活率（%）＝未着色精子数量/总精子数量×100%。精子活动率使用电脑自动精液采集分析仪进行检测。

2.4 精浆中SOD及AST的检测

取“2.3”项下各时间点的精浆，按试剂盒使用说明书检测其中SOD和AST活性。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 精子存活率与活动率检测结果

与相同时间点对照组比较，随AlCl3浓度增加，精子存活率与活动率均降低（P＜0.05或P＜0.01），呈浓度依赖性；但当Al-Cl3浓度为5 mol·L－1时，作用0、2 h时精子存活率降低无明显变化（P＞0.05），即对精子未产生明显毒性作用。与第1组相同浓度及时间点比较，AlCl3中、高剂量组作用2、4 h时上述指标均有升高（P＜0.05或P＜0.01）。各组精子存活率比较见表1，活动率比较见表2。

表1 各组精子存活率比较（%%，，n＝5）Tab 1 Comparison of survival rate of sperm（%%，，n＝5）

表1 各组精子存活率比较（%%，，n＝5）Tab 1 Comparison of survival rate of sperm（%%，，n＝5）

与相同时间点对照组比较:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与第1组相同浓度及时间点比较:#P＜0.05；与相同浓度作用0 h组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各组精子活动率比较（%%，，n＝5）Tab 2 Comparison of activity ratio of sperm（%%，，n＝5）

表2 各组精子活动率比较（%%，，n＝5）Tab 2 Comparison of activity ratio of sperm（%%，，n＝5）

与相同时间点对照组比较:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与第1组相同浓度及时间点比较:#P＜0.05，##P＜0.01；与相同浓度作用0 h组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05，##P＜0.01；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

3.2 精浆中SOD活性变化

与相同时间点对照组比较，AlCl3高剂量组SOD活性明显降低（P＜0.05）。与第1组相同浓度及时间点比较，AlCl3高剂量组SOD活性明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。各组精浆中SOD活性比较见表3（表中数据为实测值×精液稀释倍数）。

3.3 精浆中AST活性变化

与相同时间点对照组比较，第1组中作用2、4 h时AlCl3低、中、高剂量组AST活性几乎全部明显增强，第2组作用4 h时AlCl3中、高剂量组AST活性明显增强（P＜0.05或P＜0.01）。与第1组相同浓度及时间点比较，第2组作用4 h时Al-Cl3中、高剂量组AST活性明显减弱（P＜0.05）。各组精浆中AST活性比较见表4（表中数据为实测值×精液稀释倍数）。

4 讨论

精子浓度、精子活动率及存活率是评判精子质量及生育力最重要的参数，处在氧化应激状态下的人或动物，其精浆和血浆中的氧自由基明显增加，产生过氧化作用从而损伤细胞膜、DNA及亚细胞器膜，进而对细胞功能产生显著的不利影响，使精子质量明显下降而致不育。SOD是精液中最重要的抗氧化防御剂，其活性高低可作为男性不育的判断指标之一。有研究[5，6]提示，精浆中SOD活性低可作为诊断男性不育的参数之一。

有研究[7，8]证实，在体外、内铝均显示出氧化作用，能促进生物氧化。在本研究中，一定浓度的AlCl3加入精液中孵育一定时间后（浓度为15 mol·L－1、时间≥2 h），精子活动率及存活率明显降低、SOD活性明显受到抑制，且与AlCl3浓度及孵育时间具有明显的依赖性，与Yousef等[3]研究报道结果一致。AST在精子代谢转氨过程中有着重要作用。在本研究中，AlCl3增强了AST活性，与有关文献[3，8]结果相近，AST活性增强可能是由于线粒体某些结构的改变从而引起AST漏出有关:孵育时间越长，AlCl3浓度越高，线粒体结构破坏越重，AST漏出越多；而在刚加入AlCl3时，线粒体结构尚未发生改变，虽然AlCl3浓度增加，AST活性却无明显变化。但文中其他3个指标由于比较敏感，所以在刚加入AlCl3时就表现出了明显的差异。

表3 各组精浆中SOD活性比较（U·mL－1，，n＝5）Tab 3 Comparison of SOD activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

表3 各组精浆中SOD活性比较（U·mL－1，，n＝5）Tab 3 Comparison of SOD activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

与相同时间点对照组比较:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与第1组相同浓度及时间点比较:#P＜0.05，##P＜0.01；与相同浓度作用0 h组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05，##P＜0.01；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

表4 各组精浆中AST活性比较（U·mL－1，，n＝5）Tab 4 Comparison ofAST activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

表4 各组精浆中AST活性比较（U·mL－1，，n＝5）Tab 4 Comparison ofAST activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

与相同时间点对照组比较:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与第1组相同浓度及时间点比较:#P＜0.05；与相同浓度作用0 h组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

本研究结果表明，在体外，单纯加入美洛昔康与生理盐水比较，精子活动率、存活率及精浆SOD、AST活性在相同孵育时间下均无明显差异，表明美洛昔康在相近于临床治疗血药浓度时，对精液质量无明显影响，即对生育力正常者，美洛昔康不会产生不利影响。但美洛昔康对AlCl3引起的精子毒性作用却具有一定的保护作用，其可以减轻AlCl3对SOD活性的抑制作用、对AST活性的增强作用，精子活动率及存活率也有部分增强，但不能完全改善，其具体机制有待进一步研究。

综上所述，在体外试验中，AlCl3对人精液具有明显毒性作用，并表现出时间及浓度依赖性，美洛昔康对其具有明显的改善作用。

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