淋巴管生成调控机制与大肠癌临床病理特征的相关性

刘 斌，戚 峰，季 兵，巩发才，刘 彤

大肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居恶性肿瘤的前列，在全球呈上升趋势[1-2]。我们通过收集本院2008年4月—2009年3月经手术切除的60例大肠癌标本，研究大肠癌淋巴管密度与临床病理参数之间的关系，并应用基因芯片技术分析大肠癌组织淋巴管生成的可能调控基因，为大肠癌的靶向治疗提供分子生物学基础。

1 资料和方法

1.1 资料 本组共60例，男32例，女28例；年龄43～80岁，中位年龄67岁。根据肿瘤所在部位行相应的肿瘤切除及淋巴结清扫。所有标本均经病理学证实。手术前均未进行化疗、放疗、生物治疗等。

1.2 取材 标本均采集大肠癌组织、远癌切端肠组织黏膜，标本离体后取材并分为两部分，一部分置入液氮速冻后再置-80℃冰箱保存备用，另一部分置入10%中性福尔马林固定后进行石蜡包埋备用。

1.3 免疫组化染色及观察方法 将手术切除标本以抗Podoplanin抗体（Santa Cruz公司，1∶100稀释）为一抗进行免疫组化染色，按照Weidner等[3]报道的方法，先在低倍镜(×40)下扫视整个视野的肿瘤区域，选择其中的4个淋巴管密集区，然后在高倍镜(×200)下计数其淋巴管数目，取其平均值作为该例标本的LVD值。

1.4 基因芯片分析 将标本以LVD为标准分为高密度和低密度两组，每组随机选取2例标本。提取4个大肠癌组织样本mRNA，制备生物素标记的cRNA探针，与肿瘤基因芯片（OHS-802）杂交，采用化学荧光法检测特异基因表达水平，最后行图像采集与数据分析。芯片购自上海康成生物工程有限公司，包含有肿瘤抑制基因、致癌基因、信号转导分子、生长因子、生长因子受体和血管生成因子基因等480个靶基因点。

1.5 统计学方法 采用SPSS l5.0统计软件包进行数据分析,计量资料采用独立样本t检验、方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌组织和远癌切端大肠组织的LVD计数大肠癌组织的LVD为（17.72±6.93），远癌切端肠组织为（8.90±2.40），二者比较具有统计学差异(P＜ 0.05)。

2.2 大肠癌组织LVD计数与临床病理参数的关系不同分化程度、不同浸润深度、淋巴结阳性与阴性组的大肠癌组织LVD差异有统计学意义(P＜0.05)，不同年龄、性别、组织学分型间的大肠癌组织LVD无明显差异(P＞0.05），见表1。

表1 大肠癌组织LVD与临床病理参数的关系

2.3 肿瘤基因芯片检测 大肠癌组织4例，其中A、B为大肠癌组织Podoplanin表达强阳性，其LVD水平较高，C、D为大肠癌组织Podoplanin表达弱阳性，其LVD水平较低，见图1。

图1 肿瘤基因芯片扫描图片

LVD表达高的大肠癌组织比LVD表达低的大肠癌组织上调5倍以上基因有:ERCC3,AXL,LEP,UCHL1,VEGF-A；而下调5倍以上的基因有:VHL,CDC20,MMP1,TFDP1,CDKN2A,RRM1,HMMR，KLK10,ABCB1,HSPA4,SLC1A4（见图 2）

3 讨论

图2 聚类分析:A、B平均值/C、D平均值

常用的淋巴管识别技术包括淋巴管注射法、酶组织化学染色方法、电镜技术、免疫组织化学方法等。免疫组织化学方法目前被认为是鉴别淋巴管内皮细胞，尤其是与血管内皮细胞相鉴别的最佳方法。近年来对新生淋巴管的研究逐渐增多，主要是源于其特异性标记物的发现，最常用的包括Podoplanin、LYVE—1和VEGFR。郭嫦媛等[4]研究发现，免疫组织化学技术下Podoplanin染色可以作为标记淋巴管的理想实验方法。本研究选取手术切除大肠癌标本60例，同时取远癌切端肠组织作为对照，并采用抗Podoplanin抗体免疫组化进行淋巴管密度的测定，证实大肠癌组织LVD显著高于远癌切端肠黏膜组织，差异有统计学意义。提示大肠癌中有大量淋巴管生成，与大多数研究的报道结果一致。同时，LVD与大肠癌患者的性别、年龄、组织学分型之间无明显相关性(P＞0.05)，而与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移以及肿瘤的分化程度明显相关。大肠癌中LVD在淋巴结转移组中显著高于无淋巴结转移组，提示淋巴管数量的多少与淋巴结转移密切相关。大肠癌的浸润深度、淋巴结转移及分化程度是临床上反映肿瘤侵袭转移的指标，本研究显示肿瘤的淋巴管密度与大肠癌的侵袭转移明显相关，说明肿瘤的淋巴管密度在肿瘤的恶性进展过程中起着重要的促进作用。

大肠癌尤其是伴有淋巴结转移患者，术后辅助化疗已成为常规。但是对于淋巴结尚无转移的患者是否需要化疗仍无统一的认识。苏木精-伊红染色病理检查未发现有淋巴结转移的Dukes-A和Dukes-B期病人，仍有10%～25%于术后5年内复发[5]，提示存在着一种常规手段不易发现的肿瘤“微转移”。从本研究中得出，淋巴结转移阳性组与阴性组之间LVD有显著差异。但是，大肠癌手术切除标本经Podoplanin免疫组化染色，检测肿瘤组织中淋巴管数目是否可以作为筛选此类患者的手段有待进一步研究。

众所周知，大肠癌的发生为一多步骤、多阶段过程，涉及多个基因的改变。目前普遍认为，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用,及时地抑制VEGF能够阻止疾病的进展[6]，VEGF-A是大部分肿瘤和组织血管生成的关键因子[7]。Damert等[8]报道，VEGF-A在肿瘤组织中同样可以引起淋巴管的生成。Meit等[9]证明，VEGF-A是通过VEGF-C/-D/VEGFR-3这一通路促进淋巴管的生成，而且促进肿瘤的生长和转移。VEGF-A可能是肿瘤生长中最常见的上调因子，因此它可能是最常见的实体肿瘤中淋巴生成因子促进淋巴转移的因子。贝伐珠单抗注射液是VEGF抑制剂，近年研究表明在化疗的基础上加用此药，通过与VEGF特异性结合，阻止其与受体相互作用，发挥对肿瘤的多种抑制作用，能更进一步提高晚期大肠癌的有效率和总生存期。本研究显示VEGF-A是LVD表达高的大肠癌组织比LVD表达低的大肠癌组织上调5倍以上基因之一。

林希病肿瘤因子（von hippel-lindua,VHL）是公认的缺氧诱导因子的抑制因子，与HIF-1a有着复杂的相互作用，并调控其降解。VHL基因最早是作为肿瘤抑制基因被发现的，近年研究发现VHL蛋白及其mRNA失表达与肿瘤发生、发展及预后密切相关[10],VHL的降低产生过量HIF-1a的靶基因VEGF基因，促进肿瘤淋巴管的生成。本研究显示，VHL是LVD表达高的大肠癌组织平均值比LVD表达低的大肠癌组织平均值下调5倍以上基因之一。如果能够研究出一种新型抗肿瘤药物，特异性抑制肿瘤组织中VEGFA等促进淋巴管生成的基因表达，或特异性促进VHL等抑制淋巴管生成的基因表达，将为大肠癌的治疗开辟一条新的途径。因此，在基因或蛋白水平抑制某些基因的上调（如抑制VEGFA作用的环节）或下调（如增强VHL作用的环节），将有望在大肠癌的治疗道路上取得突破。

由于失访率较高，60例大肠癌患者预后及随访情况难以得到统计和分析。由于肿瘤部位所包含的细胞类型的多样性，使得人们在解释这些相关基因的表达变化与肿瘤中特定细胞类型的表型变化相关性时遇到一定的困难。本研究按照相关的功能挑选了部分基因，可以发现一些与肿瘤相关的基因表达变化。特别在原癌基因方面，不同LVD标本有不同的表达，可能与不同原癌基因在不同肿瘤发生中的作用不同有关。可以预测，大量基因芯片的检测结果对于大肠癌淋巴管生成调控基因的研究会有重要意义。

总之，本研究发现大肠癌组织中LVD随着原发肿瘤分化程度减低、浸润加深以及发生淋巴结转移而增高；高LVD的大肠癌组织与低LVD的大肠癌组织间存在差异表达的基因。

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