一个支持芥蓝起源于中国的分子证据

王冬梅 陈 琛，2 王庆彪 庄 木* 刘玉梅 杨丽梅张扬勇 方智远

（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2青岛农业大学，山东 青岛 266109）

芥蓝（Brassica oleracea var. alboglabra Baily），又名白花芥蓝、芥兰，是十字花科芸薹属一年或两年生草本植物，2n=18，在我国广东、广西、福建和台湾等地广泛种植（Panda et al.，2003；秦耀国 等，2009；张平真，2009；周禹 等，2010）。有关甘蓝类作物起源和亲缘关系的信息多数来自史料记载（Helm，1963；Thompson，1976；张平真，2009）：普通结球甘蓝和紫甘蓝大约在13世纪起源于德国；皱叶甘蓝可能原产于意大利；抱子甘蓝形成于比利时的布鲁塞尔；Boswell（1949）认为球茎甘蓝是15世纪在欧洲北部演化而成；花椰菜可能是在1490年由热那亚人从黎凡特或者塞浦路斯引入意大利；青花菜由黎凡特、塞浦路斯或者克里特岛引入意大利；芥蓝的起源有中国南方起源说和地中海沿岸起源说两种，尚缺乏充分的分子生物学证据。

SSR标记由于其多态性好以及共显性的特点（Powell et al.，1996），越来越多地应用于基因标记、图谱构建、遗传多样性分析等方面（陈全求 等，2008）。与基因组SSR相比，EST-SSR作为功能基因的一部分，在功能基因鉴定和种间通用性上更有其优越性（Gupta et al.，2003）。本试验利用甘蓝 EST-SSR标记，对芥蓝、野生甘蓝、观赏羽衣甘蓝、苤蓝、皱叶甘蓝、结球甘蓝、紫甘蓝、抱子甘蓝、青花菜和花椰菜等甘蓝类材料进行遗传多样性分析，比较芥蓝与其他甘蓝类作物之间的亲缘关系，为芥蓝起源提供分子证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料包括甘蓝类作物自交系、地方品种、一代杂种和野生甘蓝等38份。其中3份野生甘蓝由英国国际园艺研究中心（Warwick HRI，UK）引进，5份芥蓝地方品种由华南农业大学雷建军教授提供，花椰菜由中国农业科学院蔬菜花卉研究所花椰菜课题组提供，其余材料由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组收集、提供（材料编号和名称见表 1）。所有材料于2009、2010年定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南口实验农场，在芥蓝成熟期调查其植物学性状，调查标准参照《芥蓝种质资源描述规范和数据标准》（李锡香和方智远，2008）。苗期取幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取DNA。

表1 供试38份甘蓝类材料名称、类型及来源

1.2 EST-SSR分析

试验所用EST-SSR引物参见陈琛等（2010）的文献，利用8份不同甘蓝变种的材料进行引物初筛，筛选出61对EST-SSR引物，并对所有38份材料进行扩增分析。PCR反应体系为10μL，其中包括：200μmol·L-1dNTPs，上链和下链引物各2.5 pmol，0.5 U Taq酶，1×Buffer（内含1.5mmol·L-1MgCl2），25 ng DNA模板，所用试剂均购自北京博迈德科技发展有限公司。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性4min；94 ℃变性30 s，合适温度退火30 s，72 ℃延伸1min，35个循环；72 ℃延伸7min。各引物的合适退火温度根据引物合成报告单而定。8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，160 V恒压。快速银染法染色。

1.3 数据分析

在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为999。为保证数据准确、可靠，每块胶板均由两人独立记录，然后比对，有争议的数据作缺失处理。应用NTSYSpc2.11软件采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析，得到遗传相似系数，根据遗传相似系数建立聚类图。

2 结果与分析

2.1 EST-SSR扩增分析

本试验利用8个具有代表性的材料对EST-SSR引物多态性进行筛选，共得到61对扩增稳定、条带清晰、品种间带型差异较明显、易于识别的引物。用这61对EST-SSR引物对38份甘蓝类材料扩增，共扩增出174条多态性条带，每对引物扩增的等位位点数不等，变幅为1～5，平均每对引物扩增2.86条带，引物多态性总体较好。其中，引物BoE332在38份材料中的扩增结果见图1。

图1 引物BoE332在部分甘蓝类作物中的SSR扩增结果

2.2 芥蓝与其他甘蓝类作物EST-SSR标记的聚类分析

根据扩增结果建立数据矩阵后用NTSYSpc2.11软件计算不同甘蓝变种间的遗传相似系数，UPGMA法进行聚类分析得到38份甘蓝类材料的聚类分析树状图（图2）。

由图2可知，在相似系数大约为0.62处，所选甘蓝材料按地域分为三大类群：Ⅰ野生甘蓝、观赏羽衣甘蓝、结球甘蓝、紫甘蓝、皱叶甘蓝、苤蓝和抱子甘蓝。这几类除皱叶甘蓝外，其他的在史料记载中均起源于欧洲西北部沿海地区。Ⅱ青花菜和花椰菜。起源于地中海沿岸。Ⅲ芥蓝。首先作为一个单独的类群聚出，表明其与前两大类群的甘蓝类植物在进化途径上有所不同，推测其起源于中国南方。

在相似系数约为0.77处，13份芥蓝材料可分为三类（图2）。东升芥蓝（38）是一高代自交系，聚为第一类。桃山中花（31）可叶、薹兼用，本地铁种（32）为叶用芥蓝，均表现为叶形椭圆、叶面平滑，聚为第二类。其余为第三类，这类材料除长叶中熟（35）叶形为椭圆外，其他材料特点是叶形宽卵圆，叶面皱缩；老种香菇（34）、长叶中熟为薹用类型，其中长叶中熟的主薹为紫红色，侧薹商品性好；日本绿（36）来自于日本，与老种香菇、长叶中熟的亲缘关系较近；香港迟花（37）来自香港，与矮脚筷（33）的亲缘关系较近。芥蓝的植物学性状见表2。

图2 基于EST-SSR分析的38份甘蓝类材料聚类树状图

表2 芥蓝植物学性状调查结果

3 讨论

本试验将芥蓝分为三类，除高代自交系东升芥蓝独为一类外，其他两类与Okuda和Fujime（1996）根据植物学性状的分类结果及Matsui等（2002）的RAPD分析结果基本一致，主要是根据叶形和叶面进行分类。

芥蓝的起源现存有两种观点，一是中国南方起源说，在中国目前能追溯到的最早有关芥蓝的记载是宋朝苏东坡（1037～1101）的诗句“芥兰如菌蕈，脆美牙颊响”，距今已有 900多年的历史；而《中国蔬菜栽培学》（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，1987）记载最早引进中国的结球甘蓝和花椰菜，也只有300余年的历史，说明芥蓝可能原产于中国；张平真（2009）综合了各种史学资料认为芥蓝为甘蓝的一个变种，并支持芥蓝起源于中国南方的说法。二是地中海沿岸地区起源说，支持这一学说代表著作有《植物学》（中山大学和南京大学，1984）和《中国的蔬菜》（章厚朴，1988）。本试验中芥蓝首先作为一个单独的类群与其他甘蓝类作物分开，表明芥蓝与其他甘蓝类作物可能是由不同路线进化而来。野生甘蓝、观赏羽衣甘蓝、皱叶甘蓝、结球甘蓝、紫甘蓝、苤蓝、抱子甘蓝起源于欧洲西北部沿海地区；青花菜和花椰菜起源于地中海沿岸；芥蓝独立于欧洲西北部类群和地中海沿岸类群，推测其可能起源于中国。有记载早在公元前5、6世纪，一种被称为“西土蓝”的甘蓝类作物传入中国（张平真，2006），在我国副热带气候条件下，逐渐选育形成芥蓝；Song等（1988）的 RFLP研究中芥蓝为单独一类，与千头羽衣甘蓝亲缘关系较近，被认为是一种较为原始的类型，可能起源于一种由西欧传到东亚的原始羽衣甘蓝；本试验中芥蓝作为一个单独的类群首先聚出，与其他甘蓝材料的亲缘关系较远，可能是芥蓝进化形成时间较早，且进化形成的地域与其他甘蓝类作物隔离，支持芥蓝起源于中国的说法。本试验中选用的野生甘蓝都属于Brassica oleracea，全部来自英国，均聚于欧洲西北部沿海类群，表明羽衣甘蓝、皱叶甘蓝、结球甘蓝、紫甘蓝、苤蓝、抱子甘蓝可能都起源于野生甘蓝（Brassica oleracea）；而至于芥蓝的祖先，还需进一步收集范围更广的野生甘蓝和近缘野生二倍体进行分析。

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