副猪嗜血杆菌云南本地株的分离及鉴定

纪文清,胡永贵,杨贵树

(1.墨江县畜牧兽医局畜牧工作站,云南 墨江 654800; 2.云县畜牧局,云南 云县 675800;3.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201)

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎。病猪表现有体温升高(40℃以上),精神沉郁,食欲下降,呼吸困难,被毛粗乱,皮肤发红甚至发紫,消瘦,呼吸困难,关节肿大,跛行等。关节腔内渗出大量纤维素性液体。该病于 1910年由Glasser首次报道,因此又称为格拉斯氏病(Glasser's disease),呈世界性分布,我国也从部分规模化猪场中分离到该病菌[1]。在我国当前流行的优势血清型主要为 4、5、12、13型[2,3,4]。

副猪嗜血杆菌通常只感染猪,有较强的宿主特异性,主要通过空气、猪与猪之间的接触及排泄物进行传播,传染源为病猪和带菌猪。通常情况下,母猪和育肥猪是副猪嗜血杆菌的携带者,可影响 2～4周龄猪。主要在断奶后和保育期间发病,感染高峰为 4～6周龄的猪。副猪嗜血杆菌病的发病率为 10% ～15%,严重时病死率可达 50%[5]。为预防该病,国内外虽然研制了各种类型的基因工程菌苗与多价灭活菌苗,但由于副猪嗜血杆菌血清型众多,各个地方的流行菌株各不相同,各个血清型之间的交叉保护性不高,菌苗的免疫效果并不理想[6],给养殖业造成了巨大经济损失。鉴于本省未见该菌分离的相关报道,本研究通过对云南本地流行株进行分离鉴定,为该病的防制和进一步研究奠定一定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

采集于具有副猪嗜血杆菌病典型临床症状的仔猪肺脏。

1.1.2 试剂

葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、木糖、尿素、明胶、过氧化氢等,所有试剂均由云南农业大学动物医学实验教学中心提供。按常规方法制备备用。

1.2 试验方法[7]

1.2.1 病原菌分离培养

采用直接分离培养法,将病变肺脏剪断以新鲜切面在培养基上涂抹一点后,进行常规划线分离,置 37℃恒温箱培养24～48 h后,挑取可疑菌落作纯培养。挑取纯培养物接种在普通琼脂上,观察是否生长。同时挑取纯培养菌株接种在鲜血琼脂上,然后用葡萄球菌在鲜血琼脂上划线,观察有无卫星现象。

1.2.2 镜检

将分离菌株纯培养物直接涂片,革兰氏染色,镜检。

1.2.3 生化试验鉴定

1.2.3.1 糖发酵试验 将分离菌株按常规方法分别接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、木糖培养基中,37℃培养 24～48 h,观察其对各种糖的利用情况并记录结果。

1.2.3.2 尿素酶试验 将分离菌株划线接种于尿素酶培养基斜面上,37℃培养 24～48 h,观察其反应情况。培养基变粉红色至红色者为阳性反应,不变者为阴性反应[2]。

1.2.3.3 靛基质(Imdole)试验(吲哚试验) 将分离菌株接种于蛋白胨水培养基中,37℃培养 72 h后,先加少量乙醚或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁缓缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈玫瑰红者为阳性反应,反之为阴性反应。

1.2.3.4 过氧化氢酶试验 将过氧化氢溶液直接加入副猪嗜血杆菌生长的斜面上,观察气泡的产生。有气泡产生为阳性,无气泡产生为阴性。

1.2.3.5 精氨酸水解酶试验 将细菌接种于精氨酸水解酶培养基中,细菌使精氨酸降解为鸟氨酸、氨和二氧化碳,氨使培养基显碱性。指示剂呈红色为阳性。

1.2.3.6 X因子、V因子需要试验 挑取纯培养菌株接种2%月示琼脂平板上,再分别贴上浸渍有 X、V、X+V因子的圆形滤纸片。如果只有含 X+V因子的纸片周围有菌落生长,则表明该菌株既依赖 X因子又依赖V因子。如果只有含V、X+V因子的纸片周围有菌落生长,则表明该菌株只依赖V因子不依赖 X因子。如果只有含 X、X+V因子的纸片周围有菌落生长,则表明该菌株只依赖X因子不依赖V因子[8]。

1.2.3.7 氧化酶试验 取洁净滤纸 1小块,沾取纯培养菌株少许,然后加 1%盐酸四甲基对苯二胺或 1%盐酸二甲基对苯二胺试剂。细菌在与试剂接触 10 s内呈深紫色为阳性。为保证结果的准确性,分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。

2 结果

2.1 培养特性

取病变肺脏接种于巧克力琼脂培养基,37℃培养 24～48 h后可见有针尖大小、圆形、边缘整齐、灰白色半透明的小菌落生长。普通琼脂培养基上不生长。挑取典型菌落接种于鲜血培养基上,同时在上面接种金黄色葡萄球菌,置 5%～10%CO2培养箱中,37℃培养 24h,发现越靠近葡萄球菌菌落处,该分离菌菌落生长越大,而越远离葡萄球菌菌落处,该分离菌菌落生长越小,甚至无菌落(见图 1)。

图 1 鲜血琼脂培养物

2.2 分离菌株染色镜检结果

挑取纯培养后生长出的菌落经染色后见到革兰氏阴性的细小杆菌。菌体形态多样,以纤细杆状者居多,间有长而弯曲丝状菌体,个别呈两极浓染的球杆状(见图 2)。

图 2 16×100,巧克力琼脂培养物,革兰氏染色

2.3 生化试验鉴定结果

分离菌株能发酵葡萄糖、乳糖,产酸不产气,不发酵蔗糖、木糖、甘露醇,不产生靛基质,不分解尿素,不分解精氨酸,过氧化氢酶阳性,氧化酶阴性。生化试验结果见表 1。

根据细菌的培养特性、镜检结果和生化试验鉴定,该次分离菌株为副猪嗜血杆菌。

3 讨论

(1)由于副猪嗜血杆菌有较高的培养要求,其生化实验的关键是特殊培养基的选择。血清、NAD等成份的加入可以保证副猪嗜血杆菌的培养成功,但是必须保证加入的成份不改变生化试剂的pH值等生化特性。

(2)X因子是血红蛋白中的血红素及其衍生物,含铁卟啉,121℃高温下 30min不被破坏,是细菌合成细胞色素、细胞色素氧化酶、触酶和过氧化物酶等的辅基。嗜血杆菌属的多数细菌生长需要供给X因子,但分离菌株不需要 X因子,与副猪嗜血杆菌相符。V因子为辅酶I即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP),是细菌呼吸过程中起递氢作用的两种脱氢辅酶,副猪嗜血杆菌自身不能合成V因子,在分离培养时,培养基中应加入V因子。

(3)过氧化氢酶是一种以正铁血红素作为辅基的酶,所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。并且在试验中不能使用金属器具,如铂耳等。

(4)副猪嗜血杆菌十分脆弱,分离培养菌株在 4℃冰箱中保存 3 d即可死亡。病料中的副猪嗜血杆菌也只能存活6 h,给分离培养带来一定的困难。因此需在患猪剖杀或死亡后及时进行病原分离。副猪嗜血杆菌在鼻腔和气管中分离率较高,肺脏中极少分离到。本试验是从具有典型病理变化的肺脏中经常规分离到该病原,由此证明,具有典型病变的肺脏也可作为本病原的分离培养病料。

表 1 副猪嗜血杆菌生化试验结果

(5)对于猪的呼吸道疾病,如支原体肺炎、繁殖与呼吸综合征、猪流感、伪狂犬病和猪呼吸道冠状病毒等感染时,副猪嗜血杆菌的存在可加剧疾病的临诊表现。另外,一些最新报道指出,副猪嗜血杆菌可能还是引起纤维素性化脓性支气管肺炎的原发因素[9]。

(6)对于该病的诊断及防治除了要有一套临床诊断方法外,最重要的是在于平时采取综合防制措施:加强生物安全防范意识,规模化猪场要坚持自繁自养、全进全出的原则,严格控制人员的流动,杜绝外来人员的参观,进出物品严格消毒;建立良好的饲养管理环境,猪舍保持清洁卫生,按时消毒,保持舍内通风;发病时要用大剂量抗生素治疗,并进行全群药物预防,控制病原,减少应激。

(7)疫苗是预防副猪嗜血杆菌病最为有效的方法之一,但由于副猪嗜血杆菌具有明显的地方性特征,而且不同血清型菌株之间的交叉保护率很低。因此主要用当地分离的菌株制备灭活苗,可有效控制副猪嗜血杆菌病的发生[10]。

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].第五版·北京:中国农业出版社,2006:264-265.

[2] 周迎芳,李逢慧,罗超,等.副猪嗜血杆菌研究现状[J].中国畜禽种业,2008(11):59-61.

[3] 方泉明,黄冬艳.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其对小白鼠致病性试验[J].江西畜牧兽医杂志 ,2008(5):12-14.

[4] 宋凤香,闫振贵,姜世金.副猪嗜血杆菌的分离鉴定和药敏试验研究[J].山东畜牧兽医 ,2008(5):10-12.

[5] 贾爱卿,李春玲,王贵平,等.副猪嗜血杆菌毒理因子的研究现状[J].Animal Husbandry＆Veterinary Medicine,2008,40(3):92.

[6] 钟登科,魏建超,张训海,等.副猪嗜血杆菌安徽株分离鉴定与药敏试验[J].养猪,2008(1):51-52.

[7] 陆承平.兽医微生物学[M].第四版·北京:中国农业出版社,2007:258-261.

[8] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社,1995:384-467.

[9] 张婷,甘源,李贺侠,等.副猪嗜血杆菌病的诊断[J].今日畜牧兽医,2008(9):28-29.

[10] 蔡旭旺,刘正飞,陈焕春,等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报,2005(1):55-58.