蝎毒多肽抑制白血病干细胞龛内活化的实验研究*

杨向东，杨文华，史哲新，刘宝山，高 宏，张 蕾，陈艳鑫

（天津中医药大学第一附属医院血液科，天津 300193)

蝎毒多肽抑制白血病干细胞龛内活化的实验研究*

杨向东，杨文华，史哲新，刘宝山，高 宏，张 蕾，陈艳鑫

（天津中医药大学第一附属医院血液科，天津 300193)

[目的]观察蝎毒多肽（PESV）抑制白血病干细胞（LSC）在骨髓龛内的活化效应。[方法]分离白血病/急性淋巴细胞白血病（AML/ALL）患者LSC，置于Transwell小室中，分为高中低剂量组及对照组，分别加入不同浓度蝎毒多肽后培养，计算不同浓度组及不同时间段的LSC迁移率。[结果]PESV组迁移率分别为（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%，与对照组（49.10±6.12）%比较差异具有显著性（P<0.05），高剂量组迁移率高于中低剂量组。[结论]不同浓度PESV均有抑制白血病干细胞活化作用，抑制强度呈浓度依赖。

蝎毒多肽；白血病干细胞；龛；活化效应

随着白血病治疗方法不断进步，治愈白血病面临最大问题不是如何获得骨髓形态学缓解，而是如何清除患者体内白血病干细胞（LSC）。笔者研究的蝎毒多肽（PESV）是从东亚钳蝎蝎毒中分离和纯化的提取物，是一种细胞毒成分，具有较强的协同化疗药物杀伤白血病干细胞作用。近年研究表明其协同作用机制之一是抗白血病干细胞多药耐药。

1 材料

1.1 标本及白血病干细胞株 2010年1—12月，本院收治的初发及复发急性白血病（AL）患者35例，男 19 例，女 16 例，平均年龄 39.6（14～80）岁。急性非淋巴细胞白血病（ANLL）23例（其中慢性粒细胞白血病急粒变 6 例，ANLL－M53例，ANLL－M210 例，ANLL－M44例），急性淋巴细胞白血病（ALL）12例。初发21例，复发14例（复发患者至少半个月以上未用化疗）。无菌操作留取骨髓标本各3m L，肝素抗凝，经磁珠分离法分离白血病干细胞，用RPMI－1640培养液重新悬浮细胞，调整浓度至2×106个/mL备用。

1.2 PESV的制备及鉴定 利用分子筛层析技术对蝎毒冻干粉分离提取，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰。应用高效液相色谱（HPLC）仪，LC/MS联用技术鉴定结构，蝎毒多肽提取物由50～60个氨基酸残基组成的多肽，根据SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳（SDS－PAGE）测定结果，分子量主要在 6 000～7 000之间者符合本实验要求。收集PESV蛋白峰，临用时PESV用生理盐水溶解稀释成各浓度。

1.3 主要试剂及仪器 RPIM－1640（Gibco公司），青霉素、链霉素（Hyclone公司），环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司），类标准胎牛血清（兰州民海生物公司），Transwell板（Corning公司），Matrigel凝胶（BD公司），抗肿瘤坏死因子（TNF－α），（Peprotech公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），锥虫蓝（Amresco公司）。

2 方法

2.1 绘制生长曲线 锥虫蓝染色，选取活细胞数>95%的病例。调整待用细胞悬液细胞数至5×105个/mL，接种于24孔板，每天用锥虫蓝染色计活细胞数，连续7 d，绘制生长曲线。

2.2 锥虫蓝实验 选取对数生长期的细胞悬液，调整浓度至5×105个/mL，180μL接种于96孔板，分为药物组和对照组分别加入PESV 1、10、100、1000μg/mL和生理盐水各20μL，每个药物浓度设6个复孔，孵箱孵育24 h后锥虫蓝活细胞拒染法测活细胞数。细胞生长抑制率＝（空白孔平均值－加药组平均值）/空白孔平均值×100%。实验重复5次。

2.3 LSC在模拟骨髓壁龛中迁移实验 将8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜上均匀涂一层人工基底膜，5μg/10μL，使之干燥，形成一个基质屏障层。将白血病细胞PBS洗涤后，悬浮于无血清RPMI-1640培养基中，终浓度为2×105个/mL。将细胞悬液加到Transwell小室中，每小室加100μL。24孔板分为实验组和对照组各加入蝎毒多肽提取物和等量生理盐水，将小室浸泡于24孔培养板的条件培养基中。37 ℃，5%CO2培养 18 h，取出 Transwell，滤膜用甲醇固定，苏木精-伊红染色，水洗，将膜封于载玻片上，于高倍镜下计数迁移细胞数，每膜计数上、中、下、左、右5个不同位点的透过细胞数，计算平均值。

2.4 统计方法 采用线性相关分析法选择24 h药物作用浓度，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 LSC分离培养 见图1。

3.2 LSC生长曲线 白血病干细胞在体外培养24 h后进入对数生长期，96 h后进入生长平台期，见图2。

3.3 PESV（蝎毒多肽）对LSC在模拟骨髓龛中迁移能力的影响 PESV低、中、高浓度均有抑制LSC穿过人工基底膜的能力，其阻抑迁移率分别为（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%。对照组环磷酰胺（CTX）的阻抑迁移率（49.10±6.12）%。PESV组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量与中、高剂量组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；中剂量PESV与低、高剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量组抑制迁移率明显较高。见表1。倒置显微镜下，高剂量组可见侵袭小室下室内细胞数量减少，分布散乱不均，而对照组下室内细胞数量较多，多成簇分布。

表1 PESV抑制LSC透过人工基底膜迁移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

表1 PESV抑制LSC透过人工基底膜迁移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

注：与 PESV 组比较，*P<0.05；与中、低剂量组比较，▲P<0.05。

组别 浓度 迁移率实验组 PESV低剂量 25.01±6.83 PESV中剂量 36.85±3.83 PESV 高剂量 50.73±7.15▲对照组 CTX 49.10±6.12*

4 讨论

目前治愈白血病的关键之一是清除患者体内LSC，抑制白血病的复发，不仅仅是如何获得骨髓形态学缓解、免疫学缓解、遗传学缓解。LSC静止于骨髓壁龛内，通常处于G0期，并不进入细胞周期，当骨髓壁龛微环境发生变化时，LSC才会进入细胞周期，开始增殖分化。所以常规化疗药物对LSC无能为力；分子靶向药物虽然可以识别它，但不能伤害或清除LSC；同样干细胞移植也不能清除患者体内的LSC。因此，调控LSC长期保持G0期状态就尤为关键，只有这样才能使控制白血病复发或进展成为可能。

干细胞壁龛的假说是在20世纪70年代针对造血干细胞（HSCs）的特殊微环境而提出来的[1]。现已在多种生物的不同组织中明确了相应干细胞的壁龛细胞，如果蝇卵巢中的帽子细胞、末端丝状细胞和内发生鞘细胞，哺乳动物骨髓中的成骨细胞等[2]。干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞，具有自我更新和高度增殖能力，并可以分化成机体内至少一种成熟细胞。干细胞有多种重要的特征，如自我更新和分化潜能、对称及非对称性的分裂方式、处于有丝分裂G0期、具有分化为所寄居组织细胞和跨谱系分化的能力等。干细胞的生物学特性一方面是自身预先程序化的结果；另一方面受其所处微环境的影响[3]。干细胞特征的维持与干细胞所处的壁龛微环境有密切关系。干细胞壁龛可通过与干细胞之间的直接和（或）间接作用，发挥多重生物学功效—锚定干细胞并调控其处于G0期。正常情况下，干细胞寄居在组织或器官特定的壁龛中，这与干细胞和壁龛成分之间表达的黏附分子有关。钙黏蛋白和整合素介导的细胞黏附是普遍存在的壁龛锚定干细胞的机制[4]。在果蝇卵巢中，生殖干细胞（GSCs）与帽子细胞、体干细胞与内生发鞘细胞之间都存在DE-cadherin，该基因突变可以引起干细胞的丢失；在骨髓造血微环境中，HSCs能定居于以成骨细胞为主的壁龛中就与N-cadherin有关[5]。干细胞表面的整合素可以介导干细胞与ECM之间的黏附，从而使干细胞定居于壁龛中。表皮干细胞一个显著的特点是与基底膜的黏附，这种黏附也是通过整合素实现的。b1-integrin可以作为特异性较高的表皮干细胞表面标志物。干细胞壁龛可以锚定干细胞的另一个证据是它可以招募新的干细胞，即干细胞的“归巢”。对经照射宿主的骨髓移植HSCs后观察，发现移植的HSCs在细胞因子的趋化作用下最终进入宿主骨髓的HSCs壁龛中[6]。同时，干细胞壁龛还为干细胞提供了一个控制增殖、抑制分化的微环境。

现在临床应用的全蝎多属东亚钳科，全蝎主要有效成分是蝎毒多肽提取物PESV，它由多种含有20～80个氨基酸、分子量3 000～10 000蛋白组成，大多数有3～4对二硫键交联而成。PESV作为多种蝎毒抗癌组分中一种，受到越来越多学者的重视。有学者证实PESV至少通过抑制Bcl-2及促进Bax蛋白表达来诱导癌细胞凋亡的[7]；同时还在实验中发现PESV对数种肿瘤细胞具有毒性作用，可使进入S期的癌细胞明显减少，G1、S和G2期细胞的百分比增多，从而发挥其抗肿瘤作用[8]。

虽然本研究从体外实验证实PESV对白血病细胞黏附力及侵袭力的有抑制作用，并呈剂量依赖性，但白血病髓外浸润的发生是多因素、多环节、多步骤相互影响，相互作用的结果[9]。本课题组将进一步从分子生物学角度探讨PESV阻抑白血病髓外浸润的分子机制。

[1]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,etal.A cell initiating human acute myeloid leukemiaaftertransplantation intoSCIDmice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[2]Bonnet D,Dick JE.Human acutemyeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].NatMed,1997,3(7):730-737.

[3]Passegue E,Jamieson Ch,Ailles LE,et al.Normal and leukemichematopoiesis:are leukemiasa stem cell disorder or a reacquisitionofstem cellcharacteristics?[J].ProcNatlAcad SciUSA,2003,100(11):11842-11849.

[4]Gilliland DG,Jordan CT,FelixCA.Themolecularbasisof leukemia[J].Hematology,2004(1):80-97.

[5]Hope KJ,J in L,Dick JE.Acutemyeloid leukemia originates from ahierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity[J].Nat Immunol,2004,5(7):738-743.

[6]CozzioA,PassegueE,AytonPM,etal.SimilarMLL-associated leukemiasarising from self-renewing stem cellsand short-livedmyeloid progenitors[J].GenesDev,2003,17(24):3029-3035.

[7]张月英，张维东，贾 青.蝎毒多肽提取物诱导前列腺癌DU-145细胞凋亡的实验研究[J].实用癌症杂志，2006，21（3）：225－231.

[8]孔天翰，林 山，韩雪飞.蝎毒多肽对肿瘤细胞的抑制作用研究[J].中国病理生理杂志，2004，20（6）：968－972.

[9]杨文华，杨向东，史哲新，等.蝎毒多肽干预白血病细胞浸润效应及分子机制[J].天津中医药，2010，27（1）：15.

Experiment research on PESV for inhibiting activation of leucem ia stem cell in the niche

YANGXiang-dong,YANGWen-hua,SHIZhe-xin,etal
(DepartmentofHematology,The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China)

[Objective]To observe the effectof PESV(peptide extract from scorpion venom)for inhibiting the activation of leucemia stem cells(LSC)in the niche.[Methods]LSCwere isolated from patientswith AML/ALL and stored in the Transwell.Then theywere divided into four groups:high-dose group,middle-dose group,low-dose group and the positive control group.After cultured with different concentrations of PESV,the transport ratios of LSC in various concentration groups were computed at different time.[Results]The transportratiosculturedwith differentconcentrationsofPESVwere(25.01±6.83)%,(36.85±3.83)%,(50.73±7.15)%,and therewasasignificant difference compared with thatof the positive controlgroup(49.10±6.12)%(P<0.05).The transport ratio in the high-dose group ismore than that of the middle and lose-dose groups.[Conclusion]All different concentrations of PESV have the inhibiting effects against the activation of LSCwith a inhibiting intensity depending on the concentrationsof PESV.

PESV;LSC;niche;activating effect

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0329-03

天津市教委计划资助项目（OTJCYBJC1150）。

杨向东（1977-），男，硕士，主治医师，主要从事血液病临床与实验研究工作。

2011-04-10）