调气消积汤对Lewis肺肿瘤小鼠抑瘤作用及细胞凋亡影响的实验研究*

梁靓靓，陈苏宁，王晓凤，蔡玉文

调气消积汤对Lewis肺肿瘤小鼠抑瘤作用及细胞凋亡影响的实验研究*

梁靓靓1，陈苏宁1，王晓凤1，蔡玉文2

（1.中国医科大学附属盛京医院中医科，沈阳 110004；2.辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110032）

[目的]探讨调气消积汤对Lewis肺肿瘤的抑瘤作用及细胞凋亡的影响。[方法]C57BL/6小鼠常规接种Lewis肺肿瘤，随机分为：荷瘤对照组（MG）、调气消积汤组（TG）、顺铂组（DG）、综合组（ZG），每组10只。每天分别予饮用水、调气消积汤各0.4mL灌胃，共12 d；隔日1次腹腔注射生理盐水、顺铂0.13mL共3 d。观察其日常生活状况和肿瘤生长情况，应用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测调气消积汤对Lewis肺肿瘤细胞凋亡的影响。[结果]调气消积汤能改善Lewis肺肿瘤小鼠一般状况，与荷瘤对照组比差异有统计学意义（P<0.01）。各治疗组的瘤质量均低于荷瘤对照组，差异显著（P<0.01）。光镜下观察，各治疗组与荷瘤对照组比较，异型细胞较少，染色质浓缩边集，病理性核分裂较少。TUNEL法结果显示，各治疗组与荷瘤对照组相比凋亡细胞明显增多，绿色荧光强度高；尤以综合组增多最为明显。[结论]调气消积汤可以改善荷瘤小鼠的一般生活状况，对Lewis肺肿瘤有抑制作用，能促进肿瘤细胞凋亡。

调气消积汤；Lewis肺肿瘤；细胞凋亡

调气消积汤是在小柴胡汤原方基础上加味而来的临床治疗肺肿瘤的有效方剂。本实验通过观察各组荷瘤小鼠的一般状态、肿瘤的生长情况、肿瘤组织在光镜下结构的改变以及细胞凋亡的情况，来探讨调气消积汤的抑癌作用及其机制，并客观地评价其抗肿瘤效应。

1 实验材料

1.1 实验药物 1）调气消积汤由柴胡10 g，黄芩15 g，人参 10 g，半夏 15 g，炙甘草 10 g，生姜 10 g，大枣 4 枚（10g），天门冬 15g，生牡蛎 30g，莪术 15 g，白花蛇舌草20 g等组成。购于辽宁中医药大学附属医院中药局，按照中药常规煎法煎成相当于生药1×10-3g/mL，4℃冰箱保存，用前稀释至所需浓度。2）注射用顺铂（DDP），每支 10mg，齐鲁制药(海南)有限公司生产，国药准字H20073652。每日给药前用蒸馏水配制成1 g/L药液。

1.2 实验动物与瘤株 近交系C57BL/6J小鼠50只，鼠龄 10周，体质量（20±2）g，均为雌性，动物级别：清洁级，由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SC XK（京）2004-0001。Lewis肺肿瘤细胞株，由中国医科大学免疫实验室提供。

1.3 实验试剂 锥虫蓝染色液，20%乌拉坦注射液，4%多聚甲醛溶液，0.08%多聚赖氨酸（Sigm a公司），原位末端转移酶标记技术（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）等。

1.4 实验仪器 高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司，TG-W S）；小鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司，ZZ－6）；包埋机（EG 1150H）、手动石蜡切片机（RM 2235）、摊片机（HI 1150）、烘片机（HI 1220）、智能化组织脱水机（LEICA ASP 300）（德国莱卡公司）。

2 实验方法

2.1 造模[1]-100℃液氮保存的Lewis瘤株，于37℃水浴中复苏，然后接种于C57BL/6小鼠腹腔；9 d后，无菌条件下操作，取荷瘤小鼠腹水，经生理盐水洗涤后，调整细胞浓度至约2×109个/L的瘤细胞悬液，台盼蓝染色观察记录活细胞数（＞95%）；在每只小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞0.2mL，共接种48只。

2.2 分组及给药 接种5 d后，待移植瘤长至直径0.3～0.5 cm时，选取荷瘤成功的小鼠40只，按照随机数字表法随机分为荷瘤对照组（MG）、调气消积汤组（TG）、顺铂组（DG）、综合组（调气消积汤＋顺铂组）（ZG），每组10只。各组均在接种5 d后晨起空腹开始给药。根据人和鼠给药剂量换算公式[2]：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3，计算出给药量。

1）灌胃每日1次，连续12 d。TG组和ZG组分别予相当于含生药16.5g/（kg·d）的调气消积汤0.4mL；MG、DG组分别予饮用水0.4mL。

2）腹腔注射隔日1次，共3 d。DG和ZG组予顺铂注射液0.13mL；MG、TG组分别予生理盐水0.13mL。

2.3 实验观察指标

2.3.1 Lewis肺肿瘤小鼠生活状况的评价 分别在实验的第1、4、7、12天记录各组小鼠体质量及平均进食量，观察小鼠一般状态。实验结束前用ZZ-6型小鼠自主活动测试仪，检测各组小鼠在5min内的自主活动次数和站立次数。

2.3.2 Lewis肺肿瘤移植瘤质量及肿瘤抑制率的比较 在电子天平上称取瘤质量。疗效评价公式：抑瘤率＝（模型组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%。

2.3.3 Lewis肺肿瘤组织的病理形态学观察 采用苏木精—伊红（HE）染色法。石蜡组织块制作：取材和固定，修块，冲洗，脱水，透明，浸蜡，包埋。石蜡切片制作：修切蜡块，防脱片处理，切片，展片，捞片。HE染色：脱蜡，复水，染色，脱水，透明，封藏，用显微镜观察染色结果：细胞核呈鲜艳的蓝色，细胞质及细胞间质呈粉红至红色。

2.3.4 TUNEL法检测Lewis肺癌细胞凋亡 常规制作肿瘤组织石蜡切片。脱蜡及水合，加入蛋白酶K工作液，37℃反应30min。每个预处理好的样本滴加50μL脱氧核糖核苷酸末端转移（TdT）酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min（阴性对照不加TdT酶）。用激光共聚焦显微镜观察，拍照。

2.4 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析（One－Way ANOVA），方差齐时选用LSD法，方差不齐时选Dunnett’s T3疗法，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 调气消积汤对Lewis肺肿瘤小鼠生活状况的影响 实验第10天，在实验条件均一，无人为操作失误的情况下，顺铂组有1只小鼠死亡，其余各组无死亡小鼠。实验过程中，各组小鼠一般生活状况及进食量详见表1。实验结束前，记录各组小鼠在5min内的自主活动次数和站立次数，其中调气消积汤组明显高于荷瘤对照组、顺铂组、综合组（P＜0.05，P＜0.01）。顺铂组基本丧失站立能力，表现最差。见图1。

表1 各组一般状况的比较（±s）Tab.1 The generalstatusofm ice in each group（±s）

表1 各组一般状况的比较（±s）Tab.1 The generalstatusofm ice in each group（±s）

注：与荷瘤对照组比较，*P＜0.05。

数量 反应性 体毛 大便 平均进食量（g）荷瘤对照组 0 迟钝 干枯，无光泽 变软 2.03±0.75调气消积汤组 0 较灵敏 柔顺，有光泽 成形 2.85±0.28*顺铂组 1 非常迟钝 稀疏脱落，无光泽 溏便 1.10±0.22*综合组 0 迟钝 少量脱落，无光泽 稀糊状 1.37±0.36组别 死亡

3.2 调气消积汤对Lewis肺肿瘤移植瘤质量的影响 见表2。

由表2可以看出，各治疗组的瘤质量均低于荷瘤对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），说明调气消积汤具有抑制肿瘤生长的作用；其中综合组的抑瘤作用最强，抑瘤率为75.19%，顺铂组的抑瘤率为71.23%，调气消积汤组的抑瘤率为29.37%。

表2 各实验组瘤质量及抑瘤率的比（±s）Tab.2 Com parison of tumor weightand tumor inhibitory rate in each group（±s）

表2 各实验组瘤质量及抑瘤率的比（±s）Tab.2 Com parison of tumor weightand tumor inhibitory rate in each group（±s）

注：与荷瘤对照组比较，**P＜0.01。

组别 动物数量（n） 瘤质量（g） 抑瘤率（%）始 末荷瘤对照组 10 10 1.161±0.156 -调气消积汤组 10 10 0.820±0.116** 29.37顺铂组 10 9 0.334±0.089** 71.23综合组 10 10 0.288±0.076** 75.19

3.3 调气消积汤对Lewis肺癌组织病理形态学改变的影响 荷瘤对照组：肉眼可见肿瘤体积较大，形态不规则，质脆易破，切开后极少见肿瘤组织坏死。低倍镜下可见荷瘤对照组肿瘤细胞呈巢状分布且生长旺盛，细胞密集排列。高倍镜下可见肿瘤细胞密集排列，细胞大小不一，形状不规则，细胞核肥大、畸形，染色深，核染色分布不均匀，病理性核分裂相多见，异型性明显；肿瘤组织间质中少见淋巴细胞浸润。

调气消积汤组：肉眼可见肿瘤体积较荷瘤对照组略小，形态不规则，肿瘤切开时可见部分坏死。镜下可见肿瘤细胞仍密集排列，但细胞密度较荷瘤对照组有所减低，染色质浓缩边集，病理性核分裂相减少，异型细胞较少；部分瘤组织破坏，肿瘤组织间质可见多少不等的炎细胞浸润。

顺铂组：肉眼可见肿瘤体积较荷瘤对照组明显减小，形态不规则，个别标本瘤体不完整，肿瘤切开时多见坏死组织。镜下可见肿瘤细胞密度明显减低，多有肿胀、变性，病理性核分裂相明显减少，异型细胞明显减少；肿瘤组织内见大片坏死，肿瘤组织间质见较多炎细胞浸润。

综合组：肉眼可见肿瘤体积较荷瘤对照组明显减小，形态不规则，个别标本瘤体不完整，肿瘤切开时多见坏死组织。镜下可见肿瘤细胞密度明显减低，多有肿胀、变性，病理性核分裂相明显减少，异型细胞明显减少；肿瘤组织内见大片坏死，坏死残留的肿瘤细胞周围有大量淋巴细胞和白细胞浸润。

3.4 Tunel原位法检测Lewis肺肿瘤细胞凋亡 在激光共聚焦显微镜下观察Lewis肺肿瘤移植瘤细胞的凋亡，正常的活细胞不着色，凋亡的细胞呈绿色荧光。结果显示荷瘤对照组异硫氰酸荧光素（FITC）标记的肺肿瘤细胞低染，少见凋亡形态的细胞。调气消积汤组、顺铂组及综合组的肺肿瘤细胞均高染，呈绿色荧光，表明各治疗组移植瘤出现了大量凋亡的肺肿瘤细胞，其中综合组绿色荧光强度最大。

4 讨论

中医药治疗恶性肿瘤着眼于“治病求本”的原则，与手术、放疗、化疗等局部杀灭方法最大的不同是强调整体调节，多方入手及全身治疗，通过中药复方中多种成分，多层次、多环节、多靶点综合调节而发挥作用。

从多年的临床实践中体会到，晚期肺肿瘤患者，由于气机紊乱，升降失常导致的症状较多，因此重视升降辨证，调整气机的升降紊乱，采用“和法”调节肝气，使用柴胡剂化裁治疗晚期肺肿瘤，取得了较好的疗效[3]。针对肺肿瘤的致病特点，筛选有效药物立法组方而成的调气消积汤是在小柴胡汤原方基础上加味而来，在治疗中重视升降理论的应用，注重人体气机运动的调畅，是临床治疗肺肿瘤的有效方剂。方中柴胡轻清升散、宣透疏解，既可向外以解表，又能向上以升阳，还可疏泄肝胆，肝胆疏则气行有序，升降出入协调平衡；黄芩苦寒，长于清泄肺热，与柴胡合用可疏解少阳郁滞之邪热，使气机通达，枢机调和，两者共为方中君药；生牡蛎重镇安神，软坚散结；白花蛇舌草、莪术清热解毒、活血化瘀，三药共为臣药；生姜、半夏和胃止呕，燥湿化痰，辛开散结，能开能降为佐药；人参、天门冬、甘草、大枣为使，益气养阴润肺，补益脾胃，调气和中，具有增强中焦枢转气机，调和方中诸药的作用。全方配伍升中有降，散中有收，调气机，补肺气，软坚散结，活血化瘀，共奏调畅气机，抗肺肿瘤之效。

通过本实验可以看出，与荷瘤对照组比，经调气消积汤治疗后的荷瘤小鼠，进食量增加，一般生活状况改善，5min自主活动及站立次数增加，并抑制肿瘤的生长，两者差异有统计学意义。顺铂组荷瘤小鼠的一般状况最差，反应非常迟钝，基本丧失了站立的能力；而且在实验条件均一，无人为操作失误的情况下，有1只小鼠死亡，由此可以看出，虽然化疗药物抗肿瘤的能力较强，但是同时也损伤了正常细胞，对荷瘤小鼠的全身都有损害，有很强的毒副作用。综合组荷瘤小鼠的一般生活状况较顺铂组改善，且抑瘤率最高。以上实验结果说明，调气消积汤可以改善Lewis小鼠的一般状况，对肺肿瘤细胞的生长有抑制作用；与化疗药物合用可以提高疗效，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，减轻化疗毒副反应，从而提高荷瘤小鼠的生存质量。

细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一。在生物化学变化方面，凋亡的一个显著的特征就是细胞染色质DNA的降解。TUNEL法是1993年Wijsman等[4]提出的细胞凋亡的原位检测法，是一种将分子生物学与形态学相结合的研究方法。该方法灵敏度高，可以特异准确地定位正在凋亡的细胞，凋亡细胞产生的信号强度比非凋亡细胞高数十倍，测定凋亡细胞的灵敏度要比坏死细胞高10倍。实验结果显示荷瘤对照组FITC标记的肺肿瘤细胞低染，少见凋亡形态的细胞。调气消积汤组、顺铂组及综合组的肺肿瘤细胞均高染，呈绿色荧光，表明各治疗组移植瘤出现了大量凋亡的肺肿瘤细胞，其中综合组绿色荧光强度最大。实验证明了调气消积汤抑制Lewis肺肿瘤细胞的作用，可能与促进肺肿瘤细胞凋亡有关；该方与化疗药物同用，可增强促肺肿瘤细胞凋亡的能力。

中医药治疗肿瘤在治疗的过程中更重视患者的主观感受，有较好的改善症状、提高生存质量和延长生存时间的作用，虽瘤体缩小不一定明显，但通过稳定瘤体、缓解症状使患者长期带瘤生存。大量的实验证明，中西医结合对恶性肿瘤的治疗有着巨大的优势和潜力，其治疗效果优于单纯的中医和单纯的西医治疗[5-6]。

[1]刘建文.药理实验方法学[M].北京：化学工业出版社，2003：22－23.

[2]孙敬方.动物实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2001：357.

[3]邢向荣，殷东风.运用柴胡剂从肝论治提高恶性肿瘤患者生存质量的临床分析[C].第十届全国中西医结合肿瘤学术大会，2006：320－325.

[4]Cheng YL,Chang WL,Lee SC,et al.Acetone extract of Angelica sinensis Inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cyclearrestand apoptosis[J].Life Sci,2004,75(13):1579-1594.

[5]周岱翰，林丽珠，周宜强，等.非小细胞肺癌三种治疗方案的成本—效果分析[J].中国肿瘤临床，2005，32（19）：1081－1084.

[6]贾英杰，李小江，陈 亮，等.中医药在治疗癌性疼痛中的研究进展[J].天津中医药大学学报，2011，30（1）：58-60.

Effectsof the Tiaoqixiaojidecoction on anti-tumor and apoptosis inm icewith Lew is lung cancer

LIANG Jing-jing,CHENSu-ning,WANGXiao-feng,etal
(TCM department,Shengjing Hospital Affiliated to ChineseMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

[Objective]Toexplore the therapeutic effectof Tiaoqixiaoji(TQXJ)decoction on anti-tumoreffectand apoptosisof Lewis lung cancer-bearingmice.[Methods]C57BL/6micewere inoculated with Lewis lung cancer cells routinely.Then theywere random ly divided into:modelgroup(MG),TQXJgroup(TG),DDP(Cisplatin)group(DG)and TQXJ-DDPgroup(ZG),with 10mice in each group.Different drugswere given to each group in order to observe the daily life and the tumorgrowing statusof themice.Determination of the cellapoptosis in the tumorous tissuewas performed by TUNELmethod.[Results]The generalstatusof the Lewis tumor-bearingmice could be improved by TQXJDecoction comparedwith MGgroup(P<0.01).The tumorweightofeach treatmentgroupwas lighter than theMG(P<0.01).Therewere some cellmorphological changes of the TG,DG and ZG,including the chromatin condensed inmargin and the pathological karyokinesis reduced obviously compared with the MG.In situ TUNEL assay showed that increased apoptotic cells could be seen in all treatmentgroups;the green fluorescence intensitywashigh and the ZGwashighest.[Conclusion]TQXJDecoction iseffective in improving the general life statusof tumor-bearingmice，and it can inhibit the growth of the Lewis lung cancer,and also can induce the apoptosis of the Lewis lung cancer cells.

Tiaoqixiaojidecoction;Lewis lung cancer;apoptosis

梁靓靓（1971-），女，博士，讲师，主治医师，1995年毕业于辽宁中医药大学医疗系，2010年获得该校中西医结合基础专业博士学位，主要从事恶性肿瘤的中医药基础与临床研究，曾于1999—2003年在阿联酋Modern Ployclinic工作4年，目前在中国医科大学附属盛京医院中医科工作；近年来共发表学术论文20余篇，参与省、市级课题3项，博士毕业论文获辽宁中医药大学中西医结合基础医学院优秀毕业论文，现担任辽宁省中西医结合学会肿瘤专业、血液病专业委员会委员。

R734.2

A

1672-1519(2011)04-0277-04

2011-01-16）