马齿苋提取物体外清除自由基活性的研究

杨 柳,陈承杰,辛海量,李 敏*

(1.第二军医大学海医系军队卫生学教研室,上海 200433;2.上海市青浦区疾病预防控制中心五大卫生科,上海 201700;3.第二军医大学长海医院中医科,上海 200433)

马齿苋(Portulaca oleracea L.)系马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物,是药食同源野生植物之一,既有保健功能,又有药用价值。研究表明,马齿苋能降低家兔体内的血清脂质和血黏度,具有抗动脉粥样硬化和抗缺氧作用[1]。本研究自制马齿苋提取物,对其清除自由基的活性进行体外研究,为充分开发利用这一天然资源提供理论依据。

1 仪器和试药

ZX98-1旋转蒸发器(鲁伊科工贸公司);751型分光光度计(上海精密科学技术有限公司);TG332A型微量分析天平(上海天平仪器厂);H Y31-02电热恒温水浴锅(绍兴医疗器械厂),T/UT6030恒温干燥箱和Labofuge400R高速低温离心机(德国 Heraeus公司)。1,1-二苯基-2-(2′,4′,6′-三硝基苯基)肼(DPPH)(日本东京和光纯药工业株式会社);无水乙醇、95%乙醇(分析纯)、磷酸盐缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸均购自国药集团上海化学试剂有限公司;羟基自由基测试盒、抑制与产生超氧阴离子自由基(O2-◦)测试盒均购自南京建成生物工程研究所;2,6-二叔丁基对甲酚(BH T)(含量99%,南京大唐化工有限责任公司,批号090603);没食子酸对照品(批号110831-200302)和维生素C(批号100425-200702)均购自中国药品生物制品检定所;马齿苋药材(批号090728)购自上海雷允上药业有限公司,经第二军医大学药学院生药学教研室郑汉臣教授鉴定为马齿苋科马齿苋。

2 方 法

2.1 马齿苋提取物的制备 称取马齿苋药材500 g,用4000 ml 80%乙醇回流提取2次,每次1 h。合并提取液,减压除乙醇,加蒸馏水至1 g生药/ml,用10%NaOH 溶液调节 pH6.5～7.0,以2×103×g离心4 min,得沉淀,水洗沉淀物,继续离心,沉淀经干燥。将最终所得沉淀溶于无水乙醇中,分别配置成不同浓度的马齿苋样品液,待用。

2.2 清除DPPH自由基实验 准确称取25 mg DPPH置250 ml容量瓶中,用80%乙醇溶解并定容,配置成0.1 mg/ml的DPPH溶液。将2 ml不同浓度马齿苋样品液及2 ml DPPH溶液加入到同一支具塞试管中,摇匀。30 min后在 517 nm处用2 ml 80%乙醇作参比剂测定其吸光度Ai,同时测定2 ml DPPH溶液与2 ml 80%乙醇混合后吸光度A0、2 ml不同浓度马齿苋样品液与2 ml 80%乙醇混合后的吸光度Aj。评价实验样品的抗氧化能力的大小用清除率来表示。清除率计算公式:P1=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。阳性对照药选择没食子酸,同法操作,并计算清除率。

2.3 清除羟基自由基实验 严格按照羟基自由基试剂盒说明书操作。选择维生素C作为阳性对照药,同法按照试剂盒说明书操作,测定吸光度。清除率计算公式:P2=[(对照管的吸光度-测定管的吸光度)/对照管的吸光度]×100%。

2.4 抑制超氧阴离子自由基(O2-◦)实验 严格按照超氧阴离子自由基试剂盒说明书操作。选择维生素C作为阳性对照药,同法按照试剂盒说明书操作,测定吸光度。清除率计算公式同2.3项。

2.5 测定还原能力实验 取0.5 ml不同浓度的马齿苋样品溶液分别置 10 ml比色皿中,加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液2.5 ml,1%的铁氰化钾溶液2.5 ml,混匀,50℃下保温20 min后,加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml,振荡混匀后在4℃和1.5×103×g下离心 10 min。取上清液2.5 ml,加入2.5 ml蒸馏水和0.5 ml0.1%的FeCl3溶液,静置10 min后,溶液由黄色变为蓝色,在700 nm下进行比色。用蒸馏水代替马齿苋样品液做空白实验。本实验阳性对照品为人工合成抗氧化剂BHT,同法操作,并测定吸光度。每种浓度下平行测定3次。溶液的吸光度越大,表示还原能力越强。

2.6 统计学处理 每个浓度平行测量3次,结果用SPSS 13.0统计软件处理,采用两因素析因设计定量资料一元方差分析,对清除率做了平方根反正弦变换。数据均用¯x±s表示,P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果和讨论

3.1 清除DPPH自由基 DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基,呈紫色,在517 nm下有强吸收。当有自由基清除剂存在时,DPPH自由基与自由基清除剂给出的氢相结合,孤电子被配对,使其颜色由紫色变为淡黄,吸光度减少,反应结束后达到稳定[2]。因此,可通过在此波长处吸光度的测定,来检测自由基的清除情况。结果见表1。与药物、剂量、药物与剂量交互作用对应的方差分析结果分别为:F=2 135.26,P＜0.000 1;F=10 897.1,P＜0.000 1;F=797.09,P＜0.000 1。说明两种药物之间的差别、5种剂量之间的差别、药物与剂量的交互作用均有统计学意义。分别在各剂量下比较两种药物之间的差别均有统计学意义(P＜0.000 1)。

表1 马齿苋提取物对DPPH自由基的清除率Table 1 Scavenging DPPH free radical activities of extract of Portulaca oleracea

表1 马齿苋提取物对DPPH自由基的清除率Table 1 Scavenging DPPH free radical activities of extract of Portulaca oleracea

DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼

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3.2 清除羟基自由基 羟基自由基最活泼,其反应速率极快,可损伤蛋白质、核酸、脂质等多种生物大分子,尤其对脂质的过氧化作用更强[3]。在低浓度时维生素C清除羟基自由基能力较强,但在浓度达到2.50 mg/ml后趋于稳定,清除活性不再显著增加,而马齿苋提取物的清除活性与浓度呈正相关,在高浓度时清除活性明显优于维生素C,结果见表2。方差分析结果与清除DPPH自由基结果基本相同。

3.3 清除超氧阴离子自由基 超氧阴离子自由基不仅具有重要的生物功能,也与多种疾病有密切关系。它是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自由基,可经过一系列反应生成其他的氧自由基[4]。表2结果显示,维生素C在低浓度时,清除超氧阴离子自由基的能力显著优于马齿苋提取物,随着浓度的升高,马齿苋清除超氧阴离子自由基活性不断增强,效果逐渐优于维生素C。方差分析结果与清除DPPH自由基结果基本相同。

表2 马齿苋提取物对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率Table 2 Clearing rates of hydroxyl free radical and superoxide negative ion free radical by extract of Portulaca oleracea

表2 马齿苋提取物对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率Table 2 Clearing rates of hydroxyl free radical and superoxide negative ion free radical by extract of Portulaca oleracea

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3.4 还原能力测定结果 抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基的,还原力越弱,抗氧化性越强。因此,可通过测定还原力来说明抗氧化活性的大小。图 1的结果显示,在浓度0～200 μ g/ml范围内,马齿苋提取物的还原能力弱于对照药BHT,即抗氧化力强于BH T。

图1 马齿苋提取物的还原能力Figure 1 Reducing ability of extract of Portulacaoleracea

马齿苋在我国有悠久的食用历史,是最常见的中草药和野生蔬菜,药理作用广泛,它营养丰富,且来源广泛,有较强的经济药用价值。本研究发现马齿苋具有较强的清除自由基能力。马齿苋的种植及其制品的开发具有广阔的前景。但是马齿苋的应用仍然存在一些问题,首先其成分复杂,不能从分子水平上明确发挥药性的有效成分;第二,我国马齿苋资源虽然丰富,但多为野生,少有栽培,其利用率非常低。这些问题有待于科研人员进一步的研究和探索。

[1] 贺圣文,贺圣光,赵仁宏,等.野生马齿苋对家兔机体血脂及脂质过氧化作用的影响[J].中国公共卫生,1997,13(3):157-158.He ShengWen,He ShengGuang,Zhao RenHong,et al.Effects of wild Portulaca oleracea on blood lipid and lipid peroxidation in rabbits[J].J Chin Pub Health,1997,13(3):157-158.Chinese.

[2] Moon J W,马玉林,李冬鸣.唐古特大黄和绿茶不同溶剂提取物对DPPH自由基清除作用的研究[J].安徽农业科学,2010,38(26):14310-14311.Moon J W,M a YuLin,Li DongMing.Study on DPPH free radical scavenging activities of extracts from Rheum tanguticum and green tea[J].J Anhui Agri Sci,2010,38(26):14310-14311.Chinese with abstract in English.

[3] 秦德安,苏 丹,王晓玲.橙皮苷对羟自由基的消除作用[J].中国药学杂志,1996,31(7):396-398.Qin DeAn,Su Dan,Wang XiaoLing.Scavenging action to hydroxyl free radical of hesperidin[J].Chin Pharm J,1996,31(7):396-398.Chinese with abstract in English.

[4] Poon H F,Calabrese V,Scapagnini G,et al.Free radicals:key to brain aging and heme oxy genase as a cellular response to oxidative stress.[J].J Gerontol Med Sci,2004,59A(5):478-493.