贝那替秦对最大电休克发作模型和戊四氮惊厥发作阈模型小鼠的抗惊厥作用

陈小飞，李建雄，王永安

(1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850;2.解放军总参谋部总医院药剂科，北京 100091;3.解放军总医院肿瘤内科，北京 100853)

胆碱能拮抗剂贝那替秦(benactyzine)是军事医学科学院毒物药物研究所研发的“解磷注射液”的主要成分，其对有机磷毒物中毒所具有的良好治疗效果已获大量临床验证。既往研究结果表明，贝那替秦与胆碱酯酶重活化剂氯解磷定伍用时，可显著提升有机磷农药中毒患者治愈率、缩短住院时间、降低治疗费用，其作用明显优于阿托品与氯解磷定伍用的临床常规治疗方案［1］;而 McDonough 等［2］则发现贝那替秦在对抗另外一种有机磷毒物梭曼中毒所致惊厥的过程中，表现出独特的作用机制:在梭曼所致惊厥发作后期，在阿托品及东莨菪碱等抗胆碱药失去抗惊厥疗效时，贝那替秦常规剂量下仍具显著抗惊厥作用［2］。由于非胆碱能系统特别是N－甲基－D－天冬氨酸(N－methyl－D－aspartate，NMDA)、γ－氨基丁酸(gamma－aminobutyric acid，GABA)受体功能异常目前被认为可能是梭曼所致惊厥后期得以维持和延续的主要原因［3］，因此，贝那替秦在梭曼所致惊厥后期所表现出的明显抗惊厥作用，提示其抗惊厥作用机制除在于其已知的抗胆碱作用外，还可能与其对非胆碱受体的直接拮抗作用相关。

为进一步探讨贝那替秦对有机磷毒剂中毒特别是梭曼所致惊厥的作用机制，本实验通过与NMDA和GABA等非胆碱受体功能紊乱密切相关［4～5］的惊厥模型即最大电休克发作模型(maximal electroshock seizure，MES)和戊四氮惊厥发作阈模型〔penterazol(Metrazol seizure threshold test，MST)〕，评价比较了贝那替秦、盐酸戊乙奎醚及阿托品等抗胆碱药的抗惊厥疗效;在此基础上，制备致死剂量NMDA中毒小鼠模型及NMDA诱导原代培养大鼠海马神经细胞损伤模型，同时在体内体外水平进一步观察上述药物对NMDA受体的对抗作用。

1 材料与方法

1.1 小鼠

昆明小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g;由军事医学科学院实验小鼠中心提供，小鼠合格证号:SCXK－(军)－2002－001。新生 Wistar大鼠(＜12 h)。

1.2 药品和试剂

盐酸戊乙奎醚(批号:030610，纯度99.8%);阿托品(批号:051025，纯度99.1%)及贝那替秦(批号:7108，纯度98.6%)均由军事医学科学院毒物药物研究所提供;东莨菪碱，批号:K28714647购自德国Merck公司;地西泮注射液，批号:0907301，由天津金耀氨基酸有限公司生产;地佐环平(dizocilpine，MK－801)、NMDA及戊四氮为美国Sigma公司产品;噻唑蓝(MTT)为Merck产品;苯妥英钠，批号:030320及巴比妥钠，批号:000510购于北京化学试剂公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清、马血清、N－2添加剂、B－27添加剂、胰蛋白酶和L－多聚赖氨酸及阿糖胞苷均购于美国 Gibco公司;L－谷氨酰胺(批号:0508255)购自Amresco公司;青霉素，链霉素购自华北制药厂。

1.3 主要仪器

电惊厥仪(军事医学科学院仪器厂);超级洁净工作台(哈尔滨市东联电子科技有限公司);MCC/340型多孔扫描分光光度计(美国Flow公司);二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)。

1.4 最大电休克发作模型抗惊厥实验［6］675

选用抗胆碱药阿托品及盐酸戊乙奎醚作为阴性对照药，选用临床常用抗癫痫药苯妥英钠及巴比妥钠作为阳性对照药，评价、比较贝那替秦及上述药物的抗惊厥疗效。按照分组设计分别ip给予贝那替秦(2，5，10，20和40 mg·kg－1)，苯妥英钠(5，10，20和 40 mg·kg－1)，巴比妥钠(5，10，20 和 40 mg·kg－1)，阿托品(10，20 和 40 mg·kg－1)和盐酸戊乙奎醚(10，20和40 mg·kg－1)，模型对照组小鼠按0.01 ml·g－1给予相应体积的生理盐水，30 min后，参照文献［6］将齿状夹电极浸生理盐水，分别夹于小鼠两耳，然后通以周期为0.2 s，频率为60 Hz，强度为7.93 mA的电流，以给药后未出现后肢伸展的强直性惊厥作为惊厥控制的指标。

1.5 戊四氮所致惊厥模型的抗惊厥实验［6］676

按照分组设计分别ip给予贝那替秦(2，5，10，20和 40 mg·kg－1)苯妥英钠(5，10，20 和 40 mg·kg－1)、巴比妥钠(1，10，15，20 和30 mg·kg－1)、阿托品(10，20 和 40 mg·kg－1)和盐酸戊乙奎醚(10，20 和40 mg·kg－1)，模型对照组小鼠按0.01 ml·g－1给予相应体积的生理盐水，30 min后sc给予致惊剂量戊四氮 92.1 mg·kg－1，以小鼠给药后未出现躯体强直性痉挛作为惊厥控制的指标，观察药物的抗戊四氮致惊疗效。

1.6 测定对NMDA致死小鼠的对抗作用［7］

小鼠 ip给予地佐环平 2 mg·kg－1、地西泮 10，20，40 和80 mg·kg－1、阿托品10，20 和40 mg·kg－1、盐酸戊乙奎醚10，20和40 mg·kg－1及贝那替秦10，20，30 和40 mg·kg－1，30 min 后，再 ip 给予致死剂量NMDA 190 mg·kg－1，记录小鼠在NMDA 注射后4 h活存数量;对照组小鼠按 0.01 ml·g－1给予相应体积的生理盐水。

1.7MTT法测定NMDA诱导的原代培养大鼠海马神经细胞存活率［8］

新生Wistar大鼠(＜12 h)断头并分离出海马，参照既往方法分散、消化并培养海马细胞。至培养后12 d，将培养细胞的96孔板取出，吸去细胞液，分别加入由地佐环平 1 μmol·L－1、阿托品 100 μmol·L－1、盐酸戊乙奎醚 100 μmol·L－1、贝那替秦 10 和 100 μmol·L－1及 NMDA 200 μmol·L－1组成的高糖无血清DMEM，37℃ 5%CO2培养24 h(对照组不含任何药品)。此后，吸去培养液，用含10%胎牛血清及10%马血清的DMEM液洗2遍，每孔加入含浓度为MTT 0.5 g·L－1的无血清DMEM，培养4 h后吸去培养液，每孔加入10%SDS 100 μl。12～16 h后，待蓝色颗粒完全溶解，用多孔扫描分光光度计测定标本在570 nm波长处的吸光度(absorbance，A)值，细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.8 统计学分析

采用SAS软件中的Fisher精确检验及ANOVA方差分析进行统计学分析;ED50值的计算采用概率单位(Probit)法。

2 结果

2.1 贝那替秦在最大电休克发作模型的抗惊厥作用

如表1所示，在MES模型上，贝那替秦10，20和40 mg·kg－1和临床常用抗癫痫药苯妥英钠20和40 mg·kg－1及巴比妥钠 20 和 40 mg·kg－1均具明显抗惊厥作用(P ＜0.05，P ＜0.01);其中，贝那替秦抗MES 的 ED50值12.2(4.7 ～53.6)mg·kg－1低于巴比妥钠15.2(5.5 ～ 24.1)mg·kg－1及苯妥英钠 16.6(7.1 ～26.3)mg·kg－1;而阿托品及盐酸戊乙奎醚10 ～40 mg·kg－1无明显抗惊厥作用。

2.2 贝那替秦在戊四氮惊厥发作阈模型上的抗惊厥作用

如表2所示，在 MST上，贝那替秦20和40 mg·kg－1及巴比妥钠 20 和 30 mg·kg－1均具明显抗惊厥作用(P ＜0.05，P ＜0.01)，且贝那替秦抗 MST的 ED50值12.5(7.0 ～25.9)mg·kg－1同样低于临床常用抗癫痫药巴比妥钠 17.2(12.8 ～22.6)mg·kg－1;同时可见另外一种临床常用抗癫痫药苯妥英钠5，10，20和40 mg·kg－1在所选用剂量范围内无抗惊厥作用，不能测定 ED50值。此外，与在MES模型上的抗惊厥效果类似，阿托品及盐酸戊乙奎醚在所选剂量10，20和40 mg·kg－1范围内无明显抗惊厥作用。

表1 贝那替秦等药物在最大电休克发作模型(MES)上小鼠的抗惊厥作用Tab.1 Anticonvulsant effects of benactyzine and other chemicals on maximal electroshock seizure(MES)mice

2.3 贝那替秦等对NMDA致死剂量中毒小鼠的对抗作用

如表3所示，小鼠ip给予致死剂量NMDA 190 mg·kg－1后不久，模型对照组9只小鼠均出现过度激惹、前抓样运动、翘尾，最后惊厥发作导致全身抽搐，因呼吸抑制而全部死亡。与模型组相比，ip给予NMDA受体特异性拮抗剂 MK－801 2 mg·kg－1可完全对抗NMDA的致死效应(P＜0.01)，9只小鼠全部存活;贝那替秦20，30和40 mg·kg－1同样可显著提升中毒小鼠活存数量(P ＜0.05，P ＜0.01)，9 只小鼠有5～6只存活;但GABA受体激动剂地西泮10，20，40 和 80 mg·kg－1、抗胆碱药阿托品 10，20和 40 mg·kg－1及盐酸戊乙奎醚 10，20 和 40 mg·kg－1等给药组小鼠全部死亡，与模型组相比无显著差异。

表2 贝那替秦等药物在戊四氮惊厥发作阈模型(MST)小鼠上的抗惊厥作用Tab.2 Anticonvulsant effects of benactyzine and other chemicals on penterazol(Metrazol)seizure threshold test(MST)mice

2.4 贝那替秦等药物对NMDA诱导的原代培养大鼠海马神经细胞损伤的保护作用

如表 4 所示，NMDA 200 μmol·L－1可明显诱发大鼠海马神经细胞损伤;而贝那替秦1，10和100 μmol·L－1可显著对抗 NMDA 的致死效应(P ＜0.01)，其作用类似于特异性的NMDA受体拮抗剂地佐环平;而阿托品及盐酸戊乙奎醚100 μmol·L－1条件下，对海马神经细胞存活率无影响与模型对照组存活情况相当。

表3 贝那替秦等药物对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)致死小鼠的对抗作用Tab.3 Antagonism of N-methyl-D-aspartic acid(NMDA)-induced lethality by benactyzine and other chemicals in mice

表4 贝那替秦对NMDA诱导海马神经细胞损伤的作用Tab.4 Effect of benactyzine on NMDA-induced hippocampal neuron damage

3 讨论

贝那替秦是作用明确的抗胆碱药，其在梭曼所致惊厥模型的良好抗惊厥作用已经大量研究证实。为更好解释贝那替秦的良好抗毒作用机制，本实验通过建立多个经典小鼠模型，观察了贝那替秦对NMDA及GABA等非胆碱能受体的影响。

本实验结果表明，贝那替秦在MES及MST惊厥模型上均表现出明显的抗惊厥作用，并且对致死剂量的NMDA中毒小鼠及NMDA诱导的原代培养大鼠海马神经损伤具明显保护作用;其作用与经典毒蕈碱(muscarine，M)受体拮抗剂阿托品，以及同时作用于M及烟碱(nicotine，N)受体的药物—盐酸戊乙奎醚存在明显不同。

目前一般认为，GABA系统功能降低，连同NMDA受体敏感性增强是 MES主要的发生机制［4，9］;而戊四氮本身就是一种 GABA 受体拮抗剂，大剂量可通过拮抗脑内相应的GABA受体，引起相关脑区抑制性功能下降，诱发惊厥发生［5，10］。大量研究表明，许多增强 GABA 受体功能［9，11］及抑制谷氨酸(glutamate，Glu)系统功能［5，10］的药物，在 MES及MST模型上均具良好抗惊厥疗效;而一些胆碱能受体特异性拮抗剂如阿托品(M受体拮抗剂)［12～13］及盐酸戊乙奎醚(M及N受体拮抗剂)［6］均不能对抗MES或MST。因此，MES及MST无论从惊厥发生机制，还是从治疗药物而言，确与胆碱能系统无直接关系。贝那替秦在上述两种惊厥模型上所表现出的明显抗惊厥作用，初步提示贝那替秦抗惊厥作用机制可能与其对NMDA及GABA受体的直接作用相关。

为进一步明确贝那替秦对NMDA及GABA受体作用的选择性，又在NMDA致死模型上，观察了上述药物对致死剂量NMDA中毒小鼠的保护作用。

NMDA受体是Glu受体的主要亚型，致死剂量的NMDA可过度激动NMDA受体，使小鼠产生系列中毒症状，最终导致小鼠死亡。目前，NMDA致死模型被认为是“评价药物是否具有NMDA拮抗作用的药物作用终点”［14］。在NMDA致死模型上，GABA受体激动剂地西泮、M受体拮抗剂阿托品、M及N受体拮抗剂盐酸戊乙奎醚均不能对抗NMDA致死效应;而既往研究结果也已证实，Glu受体拮抗剂的其他亚型即非NMDA受体拮抗剂，对NMDA致死效应亦无对抗作用［15］。而贝那替秦在NMDA致死模型上所表现的对抗作用，则初步提示贝那替秦可能存在对NMDA受体直接拮抗作用。上述研究结果，在NMDA诱导的原代培养大鼠海马神经细胞损伤模型中得到进一步证实。在体外实验中，贝那替秦对NMDA诱导的海马神经细胞损伤仍具明显保护作用。因此，以上结果综合提示贝那替秦可能存在对NMDA受体的直接拮抗作用。

以梭曼为代表的有机磷毒剂中毒所致惊厥特别是惊厥后期的救治目前仍是国内外防化医学研究重点。既往已经证实对惊厥具明确拮抗作用的药物，如抗胆碱药、GABA受体激动剂地西泮及NMDA受体拮抗剂等，在发挥良好抗惊厥作用的同时，均存在一定缺陷。如阿托品等抗胆碱药的抗惊厥作用仅限于惊厥发作早期，在后期完全失去抗惊厥疗效;地西泮类药物尽管在惊厥后期仍具显著抗惊厥作用，但亦同时存在惊厥控制后易复发、神经保护作用差等缺点;以MK－801为代表的NMDA受体拮抗剂虽然可以发挥良好抗惊厥及神经保护作用，但其本身所具有的神经精神样副作用又限制了药物的应用，因此并无实用价值。我们前期的研究结果已经初步证实，对NMDA受体具明确拮抗作用的抗胆碱药盐酸苯环壬酯［3，12］，其对梭曼中毒所致惊厥治疗效果明显优于国外目前推荐应用的抗胆碱药阿托品;而在本实验及既往研究中，贝那替秦在梭曼所致惊厥后期所表现的良好抗毒急救效果，以及其可能存在的对NMDA受体直接拮抗作用，则进一步验证了同时作用于NMDA受体的抗胆碱药，可能成为抗梭曼所致惊厥乃至有机磷毒剂中毒治疗药物的新的选择。因此，本实验为新作用特点抗胆碱药研究提供了新的研究方向。

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