茶多酚锰络合物诱导肝癌细胞凋亡的差异蛋白质表达

翁鹭娜，蒙伟能，季学涛，李 程，黄河清

(1.厦门口岸药品检验所药理学室，福建厦门 361012;2.厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术系，福建厦门 361005)

茶多酚 (tea polyphenol，TP)来源于茶叶，由黄烷醇类、花色素类、花黄素类、缩酸及缩酚酸类组成;其中黄烷醇类又称为儿茶素类，占TP总量的70%～80%。儿茶素主要由表没食子儿茶素没食子酸酯〔(-)-epigallocatechin-3-o-gallate，EGCG)、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表儿茶素等组成［1－2］。大量实验结果发现，EGCG或其他多酚单体不仅能产生诱导肿瘤细胞凋亡的药效，而且具有杀菌效果［3－4］。TP分子内的多个邻位酚羟基可作为配体络合许多过渡金属离子，如锗(Ge)和锰(Mn)等。近期研究发现，TP和TP-Ge络合物均有诱导肺癌细胞凋亡的能力，但后者诱导效率明显高于前者［5］。本研究采用光学显微镜镜检法和流式细胞术分别研究TP-Mn诱导HepG2细胞形态变化趋势和细胞凋亡率，并采用蛋白质组学技术筛选和鉴定由TP-Mn诱导HepG2细胞凋亡表达的差异蛋白质，为后续深入研究TP-Mn诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制、揭示关键蛋白质结构与功能以及研制抗肿瘤新药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及主要仪器

HepG2细胞由中国科学院细胞研究所提供。TP购自福建天宝生物化工厂;Ge和Mn标准溶液由北京国家标准物质供应部提供;Mn标准溶液，批号BW079815，Ge标准溶液，批号GSB 04-1728-2004。硫酸锰购自国药集团化学试剂有限公司，规格:AR 500 g。氧化锗购自上海医药采购供应站;2，5-二羟基苯甲酸(DHB)购自美国ICN生物医学公司;三氟乙酸(分析纯)等化学试剂购自上海生物工程有限公司和美国Sigma公司。参照文献［1］和［5］合成TP-Mn和 TP-Ge。

TE2000-S型荧光倒置显微镜，日本 Nikon公司;EPICS XL型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司;ReflexⅢ型MALDI-TOF质谱仪，德国 Bruker公司。

1.2 HepG2细胞分组及处理

细胞分为正常对照、TP 700 mg·L－1、TP-Ge 700 mg·L－1和 TP-Mn 700 mg·L－1组，分别作用 HepG2细胞48 h。

1.3 光学显微镜观察细胞凋亡形态及流式细胞仪分析HepG2细胞的凋亡率

将培养于6孔板的正常对照、TP处理组;TP-Ge组;TP-Mn组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，PBS漂洗后严格按照试剂盒说明书要求操作，加入1 ml PI染色液，4℃避光染色30 min后立即上机检测。

1.4 HepG2细胞全蛋白质提取与分离

取培养48 h的HepG2细胞，离心弃去培养液，用PBS洗涤3次。按细胞质量和裂解液体积1∶3的比例加入裂解液，液氮反复冻融破碎细胞。随后15 000 ×g离心20 min 取上清，以每管30 μl于 －80℃冷冻保存备用。2D-PAGE技术分离肿瘤细胞HepG2的全蛋白。参考文献［6－7］分离试剂配制和实验步骤。凝胶中的蛋白质染色选用常规的银染法。

1.5 差异蛋白质筛选和质谱鉴定

参考陈东仕等［8］和林志超等［9］描述的方法进行质谱数据检索和差异蛋白质鉴定。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 TP-Mn对HepG2细胞形态的影响

图1A为无任何处理的HepG2细胞。TP处理的HepG2细胞形态无明显变化，但透光性及折光性稍微减弱，细胞数量明显减少(图 1B)。TP-Ge处理的HepG2细胞形态略有变化呈扁平的短梭形或多角形，细胞单层排列呈“铺路石”状，细胞透光性及折光性稍减低，细胞数量无明显减少(图1C)。TP-Mn组的HepG2细胞形态变化明显，透光性和折光性差，大部分细胞皱缩变形，并有大量死亡细胞漂浮在培养液中，总的细胞数量明显减少，细胞凋亡明显(图1D)。

图1 茶多酚锰络合物(TP-Mn)对HepG2细胞形态的影响(×300).细胞与药物作用48 h.A:正常对照组;B:TP 700 mg·L －1;C:TP-Ge 700 mg·L －1;D:TP-Mn 700 mg·L －1.Fig.1 Effect of tea polyphenol-manganese(TP-Mn)on HepG2 morphological changes(×300).

2.2 TP-Mn对HepG2细胞凋亡率的影响

图2结果显示，HepG2细胞的自然凋亡率为(7.6±0.7)%;TP，TP-Ge和 TP-Mn组，HepG2 细胞的凋亡率分别为(12.3 ±0.4)%，(7.0 ±0.3)%和(30.1±0.7)%。其中TP和TP-Mn处理组与正常对照组相比差异显著(P＜0.05)。尤其是TP-Mn处理组，其诱导的凋亡率是TP处理组的2.5倍。

图2 流式细胞术检测TP-Mn对HepG2细胞凋亡的影响.A:正常对照;B:TP 700 mg·L－1组;C:TP-Ge 700 mg·L－1组;D:TP-Mn 700 mg·L－1组.箭头示凋亡峰.Fig.2 Effect of TP-Mn on HepG2 apoptosis measured with flow cytometry.

2.3 TP-Mn诱导HepG2差异蛋白的表达

未经任何处理的HepG2细胞蛋白质斑点数目为1200个，其中多数蛋白质斑点分布在pH 5～8范围内，少量蛋白质斑点分布在弱酸和弱碱区域内;多数蛋白质的斑点分子量为18～70 ku(图3A)。TP处理组总蛋白质斑点数目与未经任何处理的HepG2细胞很靠近，但存在11种差异蛋白质，其中图中显示的编码为6，7，8，12，13，14，15，20和21号蛋白质斑点可视为上调蛋白，而编码为11，19号的斑点可视为下调蛋白(图3B)。TP-Mn处理组蛋白质斑点数目与未经任何处理的HepG2细胞也很靠近，其蛋白质分布也较为相似，但存在12种差异蛋白质，即图中显示的斑点编码为5，9，10和20号蛋白质斑点可视为上调蛋白，而编码为1，2，3，4，16，17，18和 19号为斑点可视为下调蛋白(图3C)。

肽质量指纹和数据库比对匹配率分析结果显示，较高匹配率的蛋白质分别为图3C中编号为18和19的蛋白斑点，分别为γ-肌动蛋白和酪氨酸3/色氨酸5-加单氧化酶激活蛋白。

图3TP-Mn诱导HepG2细胞凋亡的2D-PAGE全蛋白图谱.A:正常对照组;B:TP 100 mg·L－1组;C:TP-Mn 700 mg·L－1组.Fig.3 2D-PAGE proteome map of HepG2 apoptosis induced by TP-Mn.

3 讨论

本研究结果发现，TP和TP-Mn都具有诱导HepG2细胞凋亡的能力，尤其是TP-Mn其诱导的HepG2细胞凋亡率达到(30.1±0.67)%。前期的研究表明TP-Ge只能诱导肺癌细胞凋亡［5］;本研究也表明TP-Ge诱导HepG2细胞凋亡的能力很有限，不具备广谱性药效的特点。而TP-Mn则具有广谱性药效的特点。

TP中的主要成分EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制之一是抑制肿瘤细胞中端粒酶的活性［10］。酪氨酸3-/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白可以调节端粒酶在细胞内的着陆点，从而抑制细胞凋亡［11］。HepG2细胞经TP-Mn处理后，使该酶表达量降低，阻碍了端粒酶在肿瘤细胞内与靶蛋白结合，抑制了端粒酶活性，最终导致肿瘤细胞凋亡。此外，细胞内的γ肌动蛋白表达量下调，也导致肌动蛋白纤丝遭到破坏，从而使细胞的正常状态发生改变，加速HepG2 细胞的凋亡［12］。

本研究利用蛋白质组学技术初步探讨了TP-Mn抗肿瘤分子机制，为进一步深入研究找到了切入点，但还不够深入和全面，相关的TP-Mn诱导HepG2细胞途径和分子机制，还需要借助其他生物化学和细胞生物学分析技术进一步佐证和研究。

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