大鼠溃疡性结肠炎模型建立及COX-2、MMP-9的表达

2011-05-09聂红峰檀增宪

河北医科大学学报 2011年10期

聂红峰，张萍，檀增宪，赵发

（1.河北省邢台市人民医院胃肠肿瘤外科，河北邢台 054031；2.河北省邢台市人民医院呼吸内科，河北邢台 054031；3.河北省邯郸市中心医院放射科，河北邯郸 056001，4.河北医科大学第三医院肛肠科，河北石家庄 050051）

聂红峰1，张萍2，檀增宪3，赵发4

目的建立大鼠溃疡性结肠炎（u1cerative co1itis，UC）细胞免疫反应性动物模型，观察环氧合酶-2（cyc1ooxygenase-2，COX-2）、基质金属蛋白酶-9（matrixmeta11oproteinase9，MMP-9）在肠黏膜的表达。方法应用复合法（2，4-二硝基氯苯+乙酸）制备细胞免疫反应性UC大鼠模型；观察大鼠一般状态，结肠质量变化，大体形态黏膜损伤程度评分，HE染色病理、扫描电镜观察肠黏膜损伤程度，免疫组织化学染色观察COX-2、MMP-9的表达。结果模型组大鼠结肠质量，大体形态黏膜损伤程度评分较对照组显著增加（P＜0.05），COX-2、MMP-9的表达水平显著升高（P＜0.01）。结论复合法建立UC大鼠模型是一种较理想的UC模型，肠黏膜COX-2、MMP-9表达增加，其可能是UC的发病机制之一。

结肠炎，溃疡性；环氧化酶-2；基质金属蛋白酶9

溃疡性结肠炎（u1cerative co1itis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症，病程迁延，治愈困难，其病因及发病机制目前尚不完全清楚，与遗传、环境、免疫等因素密切相关，尤其免疫因素更显重要，成为目前研究热点。UC的患病率和发病率均呈增高趋势，被世界卫生组织列为现代疑难病之一，尤其近15年，我国UC的患病数已过20万［1］。因而，建立理想的UC动物模型，探讨UC的发病机制是目前亟需解决的问题。本研究利用复合法成功建立细胞免疫反应性UC大鼠模型，并且研究了环氧合酶-2（cyc1ooxygenase-2，COX-2）和基质金属蛋白酶-9（matrixmeta11oproteinase 9，MMP-9）在大鼠肠黏膜的改变，探讨UC的发病机制。

1 材料与方法

1.1 动物：清洁级8周龄Wistar大鼠30只，雌雄各半，体质量（270±20）g，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号，冀医动字第04084号。

1.2 试剂和药品：2，4-二硝基氯苯（2，4-ch1orodinitrobenzene，DNCB），硫化钠（Na2S）均为天津市光复精细化工研究所产品。丙酮为北京化工厂产品。乙酸（acetic acid，AA）为天津市化学试剂一厂产品。免疫组织化学染色所用试剂均购于北京中山生物技术有限公司，其中一抗COX-2（H-62）SC-7951为兔抗大鼠多克隆抗体，一抗MMP-9（C-20）SC-6840为山羊抗大鼠多克隆抗体，均为美国SANTA CRUZ公司产品。

1.3 主要仪器：石蜡切片机，型号LEICARM2125，由河北医科大学组织胚胎学教研室提供；北航医学图像分析管理系统，真彩色病理图像分析系统版本4.0，由河北医科大学第三医院实验中心提供；扫描电镜（scanning e1ectron microscope，SEM），型号，日立S-3500N，喷金喷镀仪，型号IB-3（H-7500），均由河北医科大学电镜室提供。

1.4 动物模型制备与分组：应用复合法（DNCB+ AA）制备细胞免疫反应性UC大鼠模型［2］。取30只健康成年Wistar大鼠，随机抽取10只为对照组，其余20只造模。适应性喂养标准饲料1周后，模型组大鼠颈背部用10%Na2S脱毛后，连续14d，每天以20 g/LDNCB丙酮液滴背1次，每次每鼠0.3mL，第15天用直径3mm橡胶导尿管经肛门插入结肠8cm处，注入0.04mmo1/L（0.1%）DNCB乙醇（50%）液0.25mL，第16天同部位注入8%AA溶液2mL，15s后再用5mL生理盐水冲洗。造模完成1～2周后，大鼠均出现粪便稀溏和黏液脓血便等UC常见症状。取已造模成功Wistar大鼠10只为模型组，2周后检测各项指标，其余10只造模成功大鼠，继续动态观察一般状态持续时间。

1.5 标本的制备：造模成功2周后，对照组及模型组大鼠均给予10%水合氯醛（350mg/kg体质量）腹腔注射麻醉，剖取距肛门2～10cm处结肠，共8cm沿肠系膜缘剪开肠腔，用等渗生理盐水漂洗结肠组织，去除结肠黏膜表面黏附的粪便、分泌物及血液，称结肠质量，而后平展于8倍放大镜下，肉眼观察结肠黏膜损伤程度并做形态学评分。然后，用消毒锋利刀片切取5mm×10mm大小的结肠组织（模型组包括部分结肠溃疡创面在内），浸泡于4%多聚甲醛，用于HE及免疫组织化学染色。另外，切取3mm×3mm大小结肠组织（模型组包括部分结肠溃疡创面在内），浸泡于2%（pH 7.2～7.4）戊二醛中固定，置于4℃冰箱，用于SEM样品制备。

1.6 检测指标及方法：参照朱峰等［3］制定的急性炎症大体形态损伤评分标准对标本黏膜损伤程度进行评分。具体标准如下，0分，正常，无黏膜充血，水肿，溃疡；1分，轻度，轻度黏膜充血，水肿，无溃疡；2分，轻～中度，黏膜充血，水肿，糜烂，无溃疡；3分，中度，黏膜充血，水肿，糜烂，单一溃疡；4分，重度，黏膜充血，水肿，糜烂，多发溃疡。标本经脱水、包埋、切片及常规HE染色后，行普通光镜观察。应用免疫组织化学染色SP法检测COX-2。具体步骤参照试剂盒中说明书进行。一抗COX-2用0.01moL/LPBS（pH 7.4）缓冲液1∶75稀释，一抗MMP-9用0.01mo1/LPBS（pH 7.4）缓冲液1∶50稀释，阴性对照用PBS替代一抗。实验结果判定，以细胞出现棕黄色染色为阳性。真彩色病理图像分析系统处理，每一玻片任选5个视野，应用真彩色病理图像分析系统自动检测阳性细胞平均灰度，阳性细胞积分光密度，分别取其平均值，进行统计分析。SEM样品制备及肠黏膜损伤程度观察，脱水，取出已固定好的样品用双蒸水清洗3次，10min/次；用乙醇“梯度脱水法”，逐步取代样品中的水分，脱水剂的浓度由低至高依次为50%、70%、80%、90%、100%各1次，15min/次；将其置于75%叔丁醇溶液中10min，用100%叔丁醇冲洗10min，然后把样品再放入100%叔丁醇中，置于冰箱冷冻室。干燥，将样品置于IB-3真空镀膜仪，抽真空2h。镀膜，将干燥好的样品黏于样品台上，用IB-3真空镀膜仪喷金3min。观察，应用SEM观察肠黏膜形态变化。

1.7 统计学方法：应用SAS 8.0软件对所有数据进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型组大鼠一般状态：造模动物于造模起1～2周，相继出现局部皮肤炎症损害及结痂，动物毛色失去光泽，精神倦怠甚至萎靡，活动及进食明显减少，体质量下降等变化。造模完成后5～10d，所有造模动物开始腹泻，其肛周污秽、粪便恶臭，并出现黏液脓血便或粪便稀溏等UC常见症状，可持续12～16周。

2.2 各组大鼠大体形态，结肠质量和肠黏膜损伤程度评分：大体形态观察，对照组肠黏膜光滑，无水肿、出血、溃疡、肠壁增厚等表现；模型组肠黏膜充血、水肿、糜烂、坏死、肠壁增厚、溃疡形成。与对照组相比，模型组结肠质量明显增加（P＜0.05），肠黏膜损伤程度评分也明显增加（P＜0.05），见表1。

表1 各组结肠质量及大体形态损伤评分比较Table 1 TheResultsof colon weight and scoring of grossmorphologic damage（n=10，±s）

*P＜0.01 vs contro1group by t test

Groups Co1on weight（m/g）Damage score（scrores）Contro1 1.74±0.14 0.44±0.21 Mode1 4.20±0.22*3.98±0.32*

2.3 HE染色病理观察：对照组表现为正常结肠结构，黏膜表面平滑，无环状皱襞和绒毛，但有很多肠腺开口，固有层可见大量呈直管状、紧密排列的肠腺和部分孤立淋巴小结；黏膜下层由疏松结缔组织构成，含有较多淋巴细胞，可见血管、淋巴组织和神经纤维；肌层由内环行和外纵行两层平滑肌组成；浆膜完整（图1A，B）。模型组均为典型炎症黏膜表现，可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润，溃疡边缘腺体增生或呈不典型增生，腺体破坏，结构紊乱，杯状细胞减少，隐窝脓肿形成，黏膜下层出血、水肿，毛细血管扩张（图1C，D）。

2.4 肠黏膜损伤SEM观察：对照组表现为正常上皮，结肠黏膜表面为一层平滑似天鹅绒样的微绒毛毯，被有序的凹沟分割，也可见规则构型的隐窝开口，内有黏液样物质，偶见杯状细胞散布在肠上皮细胞之间，看似小点状轻微凹陷的小腔（图2A，B）。模型组为典型炎症黏膜表现，正常表皮结构严重破坏，腺隐窝明显扩大，杯状细胞显著排空，形成不规则火山口样区域，表皮微绒毛毯严重缺损甚至消失（图2C～E）。

2.5 COX-2，MMP-9免疫组织化学染色镜检及图像分析结果：对照组仅可见肠黏膜上皮为轻度的COX-2免疫染色，偶见间质细胞轻度染色；模型组肠组织可见黏膜上皮细胞为棕黄色深染，也可见部分深染的间质细胞，另外，还发现某些肠组织肌层有深染的细胞，不能确定类型，上述阳性细胞均为胞浆着色。与正常对照组比较，模型组COX-2免疫反应阳性细胞平均灰度值降低，积分光密度值明显升高（P＜0.01），见表2。对照组可见肠黏膜腺细胞呈MMP-9免疫阳性轻度染色，模型组可见肠黏膜腺细胞为棕黄色深染，也可见部分深染的间质细胞。与对照组比较，模型组MMP-9免疫反应阳性细胞平均灰度值降低，积分光密度值明显升高（P＜0.01）。见表3。表明COX-2和MMP-9表达水平显著升高。

表2 平均灰度和积分光密度值（COX-2免疫组织化学染色）Tab le 2 Average gray scale and the integrated optical density（COX-2 IHC staining）（n=10，±s）

*P＜0.01 vs contro1group by t test

Groups Average gray sca1e Integrated optica1density Contro1 158.93±21.49 0.65±0.25 Mode1 71.06±13.29*1.78±0.28*

表3 平均灰度和积分光密度值（MMP-9免疫组织化学染色）Tab le3 Average gray scale and the integrated optical density（MM P-9 IHC staining）（n=10，±s）

*P＜0.01 vs contro1group by t test

Groups Average gray sca1e Integrated optica1density Contro1 153.93±15.27 0.63±0.19 Mode1 76.06±10.91*1.74±0.24*

3 讨论

UC发病可能是遗传、环境、免疫等多种病因导致遗传易感性机体对肠道黏膜抗原免疫应答失调所致，但其发病机制尚未完全清楚。在临床上，UC具有慢性和消耗性的特征，可导致结肠癌危险性增加。国内外对UC的发病学和治疗学研究日益受到重视。

在最近几十年中，UC病因和发病机制领域最明显的进展来自对UC动物模型的研究。目前，UC动物模型制备方法较多［4］，主要包括以下几种，化学法、免疫法、复合法［5］、基因型动物模型制备、中医证型造模法等，其中，基因型动物模型，包括基因敲除型模型［6］、转基因模型正在实验研究，有待进一步改进和完善。本实验应用DNCB和AA复合法成功制备大鼠UC模型（其中单纯DNCB法属于免疫法，单纯AA属于化学法），为典型的胃肠道迟发过敏反应性模型，具备以下特点，①造模大鼠临床症状与人类UC相似，均出现黏液脓血便或粪便稀溏等。②病理变化符合UC特征，造模大鼠结肠组织大体观察，可见肠黏膜充血、水肿、糜烂、坏死、肠壁增厚、溃疡形成；HE染色病理观察，可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润，溃疡边缘腺体增生或呈不典型增生，杯状细胞减少，隐窝脓肿形成，黏膜下层出血、水肿，毛细血管扩张。SEM可见典型炎症黏膜表现，正常表皮结构严重破坏，腺隐窝明显扩大，杯状细胞显著排空，形成不规则火山口样区域，表皮微绒毛毯严重缺损甚至消失。上述病理变化均为人类UC典型组织学特征。③是一种典型的胃肠道迟发过敏免疫反应模型。江学良等［2］在制备此模型时，监测了UC的免疫指标CD4+、CD29+T细胞亚群变化，发现较造模前明显升高，符合免疫反应模型的要求。且与人类CD4+、CD29+T亚群细胞变化一致。安晓霞等［7］应用此法制备小鼠UC模型时，同样证实CD4+、CD29+T细胞亚群变化与人类相似。④病程长。本模型可持续16周，有急性发作和慢性发展过程。本模型克服了单纯DNCB法病程短，自愈性强的特点。⑤成功率高，重复性好，简单易行。因而DNCB和AA复合法制备的大鼠UC模型是一种类似人类病变的理想的UC模型。

COX-2是一种和炎症密切相关的诱导型环氧化酶，可将花生四稀酸代谢成各种前列腺素产物，参与机体炎症病理过程。花生四烯酸代谢异常是炎症肠病重要的致病环节。研究发现［8］COX-2在正常结肠组织未检测到，在UC切除标本高表达，定位于结肠表面上皮细胞和黏膜固有层单个核细胞。本研究结果显示，COX-2蛋白表达在正常大鼠结肠上皮细胞中仅为低强度，在UC上皮细胞中则明显增高，且形成高强度染色带，固有层也可见高强度染色的间质细胞，和上述研究结果相一致，这提示COX -2表达受炎症介质的诱导，这也可以解释以前研究的发现，即UC患者黏膜和直肠渗液内前列腺素E2（prostag1andin E2，PGE2）水平增高，PGE2引起炎性肠病（inf1ammatory bowe1disease，IBD）上皮细胞增殖、黏膜充血和血管扩张的原因。Roberts等［9］应用原位免疫杂交技术检测UC患者COX-2定位，显示COX-2定位于围绕结肠平滑肌细胞和固有层炎症细胞的间质神经丛神经细胞。本研究也发现部分UC大鼠肌层可见高强度染色阳性细胞，但未能确定细胞性质。这就可以解释IBD时结肠动力学改变引起的疼痛和腹泻等临床症状，即在IBD时神经丛神经细胞COX-2表达增高，进而引起前列腺素合成增多，导致上述症状。由上可见，阻断COX-2可能是治疗UC的一个有效途径。

基质金属蛋白酶（matrix meta11oproteinases，MMPs）是自然界进化中高度保守的一类酶，因含有金属（锌，钙）离子而得名，是细胞外基质降解过程中必不可少的酶，因而在组织重塑、细胞迁移、血管形成、切口愈合、炎症、肿瘤侵袭转移等各种生理病理过程中发挥关键作用。MMP-9是MMPs家族中的重要成员。MMP-9表达在IBD发病中的作用，目前研究较少。Tar1ton等［10］通过向严重联合免疫缺陷鼠转染CD4（+）T淋巴细胞制备结肠炎模型，应用凝胶电泳及原位酶谱分析丝氨酸蛋白水解酶和MMPs在IBD模型中的活性。结果发现在结肠炎组织，丝氨酸蛋白酶水平提高；同时MMP-9、MMP-2激活和表达提高，而且，蛋白水解作用主要发生于淋巴细胞浸润区域，炎症累及全层的结肠区域可见整个黏膜层、黏膜下层和肌层均显示丝氨酸蛋白酶和MMPs水平提高。上述结果提示激活和表达增高的蛋白酶通过破坏结肠黏膜屏障功能导致IBD的进展，同时也证明了丝氨酸蛋白酶是MMPs活化的关键酶。本实验应用免疫组织化学技术检测UC大鼠肠黏膜MMP-9的表达，发现模型组平均灰度明显低于对照组，模型组的积分光密度明显高于正常对照组，反映了UC大鼠MMP-9的表达强度明显高于正常大鼠。这些发现与Tar1ton等［10］在转基因UC鼠模型的检测结果相一致。提示MMP-9在UC溃疡形成、组织破坏中起重要作用。

总之，本研究应用复合法（DNCB+AA）建立了较理想的UC细胞免疫反应性模型，可以用于探索UC发病的免疫学机制，同时通过检测COX-2和MMP-9在UC大鼠结肠黏膜的变化，提示COX-2和MMP-9的表达增加可能是UC的发病机制之一。（本文图见封二）

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（本文编辑：赵丽洁）

ESTABLISHMENT OF ULCERATIVE COLITISMODEL IN RATS AND EXPRESSION OF COX-2 AND MMP-9

NIE Hongfeng1，ZHANG Ping2，TAN Zengxian3，ZHAO Fa4
（1.Department of Gastrointestinal Cancer Surgery，the People's Hospital of Xingtai City，Hebei Province，Xingtai054031，China；2.Department of Respiratory Medicine，the People's Hospital of Xingtai City，Hebei Province，Xingtai054031，China；3.Department of Radiology，the Center Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China；4.Departmentof Coloproctology，the Third Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050051，China）

Ob jective To estab1ish a ratmode1with ce11u1ar immunoreactive u1cerative co1itis（UC）and to investigate the expression of cyc1ooxygenase-2（COX-2）and matrixmeta11oproteinase 9（MMP-9）in the intestina1 mucosa of rat with UC.MethodsThe rats mode1 with ce11u1ar immunoreactive UC were induced by compound method（2，4-ch1orodinitrobenzene and acetic acid）. Measurement index inc1uded genera1 state，co1on weight，scoring of gross morpho1ogic damage in acute inf1ammation，patho1ogic observation of tissues by HE staining，observation under scanning e1ectron microscope（SEM），COX-2 and MMP-9 expression by immunohistochemistry staining.ResultsCompared with those in contro1 group，co1on weight，scoring of grossmorpho1ogic damage，expressions of COX-2 and MMP-9 weremarked1y higher inmode1group.ConclusionThe rat UCmode1induced by compoundmethod is an idea1mode1.The increased expression of COX-2 and MMP-9 might be invo1ved in the pathogenesis of UC.

co1itis，u1cerative；cyc1ooxygenase 2；matrixmeta11oproteinase 9

R574.62

1007-3205（2011）10-1130-05

2011-05-12；

2011-06-05

聂红峰（1976-），男，河北沙河人，河北省邢台市人民医院主治医师，医学硕士，从事胃肠肿瘤外科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2011.10.006