牛磺酸对高糖诱导的大鼠血管内皮细胞氧化应激与凋亡的保护作用

陈海英，杨 文，张 艳

(1.海口市琼山区人民医院，海南 海口 571100;2.海南医学院 热带医学与检验医学院 实验中心，海南 海口 570100;3.海南省干部疗养院，海南 海口 571100)

糖尿病时糖脂代谢紊乱，血管紧张素Ⅱ释放增加，均可刺激活性氧(ROS)产生而损伤血管内膜，引起内皮细胞凋亡，进而促进血管病变的发生[1]。牛磺酸是一种含硫氨基酸，在眼、血管和胆囊中具有解毒和抗氧化作用，在心血管方面也有广泛作用[2]。本研究观察牛磺酸对高糖培养下诱导大鼠血管内皮细胞氧化应激与凋亡的影响，为防治糖尿病血管并发症提供实验依据。

1 材料

牛磺酸，北京世纪维他生物技术有限公司;胰蛋白酶，Sigma 公司;2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2-DCFDA)，Santa Cruz公司;DMEM培养基、小牛血清，Gibco公司。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

健康Wistar大鼠，清洁级，12周龄，广东省医学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(粤)2003-0002。

2 方法

2.1 细胞培养

处死大鼠，取胸主动脉，去除血管外膜及脂肪组织，组织块法培养内皮细胞，在37℃，5%CO2，含10%小牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞达80%融合状态，用0.25%胰酶消化传代，第4代细胞用于实验。

2.2 细胞分组

取对数生长期的第4代内皮细胞，调整细胞终浓度为2×105/mL，置于6孔板中，每孔10 mL，在含10%小牛血清的DMEM培养基中加入葡萄糖，使其终浓度为30 mmol/L，于5%CO2、37℃培养箱中继续培养。将细胞分成 5组，分别为 0，2.5，5，10，20 mmol/L牛磺酸共培养24 h，每组3个复孔。

2.3 大鼠血管内皮细胞氧化应激

流式细胞仪测定内皮细胞内ROS含量。细胞与牛磺酸作用24 h后，加入终浓度为10 μmol/L的H2-DCFDA，置于CO2恒温培养箱，60 min后吸去培养液。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞一次，用含0.01%EDTA的胰酶消化细胞，吹打制成单细胞悬液。FACScan型流式细胞仪检测各组细胞的阳性细胞比率[3]。比色法测定内皮细胞培养基中MDA含量和SOD活性:参照试剂盒说明，测定脂质过氧化终产物MDA含量和SOD活性，细胞蛋白质定量采用Lowry法。

2.4 流式细胞仪测定内皮细胞凋亡率

将单细胞悬液1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS漂洗，重复一次;用200目筛网过滤，再以1500 r/min离心5 min，加入碘化丙啶(PI)溶液0.5 mL，终浓度为10 mg/L，室温避光30 min后上流式细胞仪进行检测[4]。数据以对数(log)采集，进行免疫荧光数据分析，计算细胞的凋亡率。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 牛磺酸对高糖诱导大鼠血管内皮细胞ROS及凋亡的影响

结果见表1。0～20 mmol/L组内皮细胞内ROS荧光值依次降低，各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);与0 mmol/L组相比，5 mmol/L牛磺酸能显著降低内皮细胞凋亡率(P＜0.05)，10 mmol/L组抑制细胞凋亡作用更显著(P＜0.01);20与10 mmol/L牛磺酸抑制凋亡作用无显著差异。

表1 牛磺酸对高糖诱导大鼠血管内皮细胞内ROS及凋亡的影响(，n=3)

表1 牛磺酸对高糖诱导大鼠血管内皮细胞内ROS及凋亡的影响(，n=3)

与0 mmol/L比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01

浓度/(mmol/L) ROS(荧光强度) 凋亡率/%09.24 ±0.12 18.52 ±1.642.5 8.15 ±0.131 18.26 ±1.1757.02 ±0.151 16.24 ±1.011 10 5.61 ±0.072 13.59 ±1.132 20 4.13 ±0.092 13.32 ±0.952

3.2 牛磺酸对高糖致大鼠血管内皮细胞MDA和SOD的影响

结果见表2。与0 mmol/L组比较，2.5 mmol/L牛磺酸对MDA和SOD无明显影响(P＞0.05);5～20 mmol/L牛磺酸，MDA含量逐渐降低，而SOD活性逐渐增强，各浓度组间比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

4 讨论

糖尿病是一种由复合病因引起的以高血糖为特征的代谢综合征，发病机制尚未阐明。目前认为与遗传、环境及自身免疫等因素相关。糖尿病患者发生心血管并发症的几率是非糖尿病患者的2～4倍，而内皮细胞凋亡是早期血管病变过程中重要的启动环节[5]。

表2 牛磺酸对高糖致大鼠血管内皮细胞中MDA、SOD的影响(，n=3)

表2 牛磺酸对高糖致大鼠血管内皮细胞中MDA、SOD的影响(，n=3)

与0 mmol/L比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01

浓度/(mmol/L) MDA/(nmol/mg) SOD/(U/mg)06.47 ±0.49 92.55 ±16.252.5 6.26 ±0.51 94.37 ±15.6854.83 ±0.221 116.45 ±14.361 10 2.73 ±0.302 136.72 ±12.842 20 1.62 ±0.352 153.56 ±12.432

本研究通过观察不同浓度牛磺酸对高糖培养大鼠血管内皮细胞的氧化应激及凋亡率的变化，结果显示，2.5～20 mmol/L牛磺酸对内皮细胞内ROS的抑制作用呈浓度依赖性，且各组间比较均有显著差异;与对照组相比，2.5 mmol/L牛磺酸对内皮细胞凋亡率无明显影响，5～10 mmol/L牛磺酸抑制内皮细胞凋亡作用逐渐增强;5～20 mmol/L牛磺酸使MDA含量逐渐降低，而SOD活性逐渐增强。提示牛磺酸可削弱体外高糖培养诱导大鼠主动脉内皮细胞的氧化应激反应，一定浓度牛磺酸具有抗内皮细胞凋亡作用。其可能机制为牛磺酸是一种具有多种生物学功能的含硫氨基酸，除能改善内分泌状态，增强人体免疫外，还有一定降血糖作用，且不依赖于增加胰岛素的释放;另外，牛磺酸可能通过稳定细胞膜、抗氧化、清除氧自由基等方式，对体外培养内皮细胞凋亡具有保护作用。

总之，牛磺酸能抑制内皮细胞氧化应激，减少细胞凋亡，对防治糖尿病并发血管疾病具有重要临床意义，但其具体作用机制尚有待进一步研究。

[1]何 敏，徐济良，吴 锋.2型糖尿病大鼠主动脉内皮细胞氧化损伤及缬沙坦的保护作用[J].中国药理学通报，2007，23(3):354-358.

[2]臧恒昌，翟光喜，张泰松，等.牛磺酸应用于心血管疾病的研究进展[J].中国生化药物杂志，2001，22(4):215-216.

[3]柴大军，林金秀，许昌声，等.视黄醇类X受体激动剂抑制高糖诱导内皮细胞氧化应激[J].中华高血压杂志，2009，17(11):1010-1014.

[4]冯月秋，王束枚，张岫美.乙酰葛根素对血管紧张素Ⅱ致血管内皮细胞凋亡的抑制作用[J].中国生化药物杂志，2007，28(1):11-14.

[5]邱雅慧.血管内皮细胞的功能以及损伤修复与动脉粥样硬化[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(10):1927-1929.