褪黑素改善胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的摄取

佘美华，侯洪杰，胡小波，尹卫东

(南华大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系，湖南 衡阳 421001)

褪黑素(melatonin，MLT)是松果体分泌的一种神经内分泌激素，研究证实它参与了体内物质和能量的代谢。研究显示MLT从多个方面对糖尿病及其慢性并发症提供保护作用，可能参与了调节机体葡萄糖稳态。本课题以3T3-L1脂肪细胞作为研究对象，采用游离脂肪酸(FFA，棕榈酸)来诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞发生胰岛素抵抗，测定细胞葡萄糖摄取能力以及MLT的作用。

1 材料

MLT(纯度＞99%)由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供;3T3-L1前体脂肪细胞株购自中科院上海细胞生物所细胞中心;DMEM低糖培养基购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州赛乐生物科技有限公司。

2 方法

2.1 3T3-L1脂肪细胞的培养和诱导

细胞生长于含10%FBS、1×105u/mL青霉素和10 mg/mL链霉素的DMEM低糖培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。细胞经传代和收集，待细胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、1 μmol/L 地塞米松、5 μg/mL胰岛素、含10%FBS的DMEM培养48 h，再换以含5 μg/mL胰岛素的培养液再培养96 h，中间换液一次，随后以含10%FBS的DMEM培养液继续培养，油红O染色后显微镜下观察。诱导分化8～12 d的3T3-L1细胞90%多呈脂肪细胞表型，可用于研究。

2.2 MLT对FFA诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

将诱导成功的脂肪细胞用FFA(300 μmol/L棕榈酸)或不用 FFA处理6 h，然后用50，100，200 nmol/L胰岛素诱导进行葡萄糖摄取的研究。液体闪烁仪测定各组细胞的葡萄糖摄取能力[1]。根据抑制程度选择最佳胰岛素作用浓度。

FFA处理脂肪细胞6 h，处理结束前30 min加入胰岛素或(和)MLT(10 nmol/L)处理共孵育至结束，测定各组细胞的葡萄糖摄取能力。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 3T3-L1细胞分化前和分化成熟后形态学的变化和比较

诱导分化前的3T3-L1细胞呈梭形、胞浆中无脂滴，表现为纤维母样的前脂肪细胞形态(图1A)。诱导分化10 d后，90%的3T3-L1细胞都分化为成熟的脂肪细胞，细胞增大，呈圆形，胞浆丰富，含有大量的脂滴(图1B)，油红O染色显示脂滴富集于核周，形成“戒环样”结构，呈典型的成熟脂肪细胞的形态(图1C)。

图1 3T3-L1细胞分化前和分化成熟后形态Fig.1 Morphous of 3T3-L1 adeadipocytes and adipocytes

3.2 FFA对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力的影响

3T3-L1脂肪细胞在加或不加FFA处理6 h后，分别用不同浓度胰岛素诱导检测其葡萄糖摄取能力，结果见表1。未加处理的3T3-L1脂肪细胞随着胰岛素浓度的增加其葡萄糖摄取量逐渐增加;而在较低浓度胰岛素刺激下，FFA处理的脂肪细胞对葡萄糖的摄入量变化不明显，当胰岛素浓度增加到200 nmol/L时其摄取量增加，但仍显著的低于未处理组(P＜0.01)。当胰岛素浓度为100 nmol/L时，FFA处理组和未处理组细胞的葡萄糖摄入差别尤为明显。

3.3 MLT对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力的影响

FFA处理6 h后的3T3-L1脂肪细胞，分别接受不同处理，各组细胞的葡萄糖摄取能力结果如表2。与未经处理组相比，FFA各处理组的摄取能力均降低，配对检验的结果显示各组间差异显著(P＜0.05);对于FFA处理组，MLT和胰岛素联合使用时，葡萄糖的摄取明显高于单独使用胰岛素时(P＜0.05)，说明MLT能显著促进胰岛素介导的葡萄糖摄取能力，而这一作用在对照组并无体现。

表1 FFA对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力的影响(，n=3)Tab.1 Effects of FFA on the glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes(，n=3)

表1 FFA对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力的影响(，n=3)Tab.1 Effects of FFA on the glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes(，n=3)

与正常细胞比较:1P＜0.01 1P ＜0.01 vs normal adipocytes

胰岛素浓度/(nmol/L)葡糖糖摄取/(cpm)正常细胞 FFA处理细胞01413.2 ±14.5 994.5 ±75.450 2243.9 ±127.4 1170.7 ±39.31 100 4146.3 ±118.4 1292.7 ±106.21 200 4829.3 ±95.1 2487.8 ±153.81

4 讨论

近年来有关FFA与2型糖尿病(2-DM)的研究成为热点，Boden等[2]指出2-DM中糖代谢紊乱的根源是脂代谢紊乱，认为循环中FFA浓度过高以及细胞内脂质过多，既导致β细胞分泌胰岛素功能缺陷，又产生胰岛素抵抗，即FFA的“脂毒性”作用，提议更名2-DM为“糖脂病”。

表2 MLT对FFA诱导的3T3-L1胰岛素抵抗细胞葡萄糖摄取能力的影响(，n=3)Tab.2 Effect of MLT on the glucose uptake in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes induced by FFA(，n=3)

表2 MLT对FFA诱导的3T3-L1胰岛素抵抗细胞葡萄糖摄取能力的影响(，n=3)Tab.2 Effect of MLT on the glucose uptake in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes induced by FFA(，n=3)

与生理盐水组比较:1P＜0.05;与胰岛素组比较:2P＜0.05;与正常细胞比较:3P＜0.051P ＜0.05 vs saline group;2P ＜0.05 vs insulin group;3P ＜0.05 vs normal adipocytes

组 别 葡萄糖摄取/(cpm)正常细胞 FFA 处理细胞生理盐水组 1413.2 ±14.5 994.5 ±75.43胰岛素组 3832.0 ±106.011914.0 ±118.43胰岛素 +MLT 组 3937.0 ±29.01 2832.0 ±130.61，2，3

我们以分化成熟的脂肪细胞作为研究对象，采用FFA孵育细胞，试图诱导建立胰岛素抵抗的细胞模型。对细胞进行FFA(300 μmol/L棕榈酸)处理6 h后，葡萄糖的摄取结果显示，对照组3T3-L1脂肪细胞(正常细胞)随着胰岛素浓度的增加其葡萄糖摄取量是逐渐增加的，而FFA处理的脂肪细胞则增加缓慢;无论是基础状态下的还是胰岛素刺激的葡萄糖摄取，FFA处理组细胞的摄取能力都远远低于对照组，尤其是当胰岛素刺激浓度为100 nmol/L时，FFA处理细胞的葡萄摄取率较对照组降低了60%以上。这说明3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取受到FFA的抑制，胰岛素抵抗模型建立成功。

进一步用MLT孵育上述胰岛素抵抗的脂肪细胞，结果发现MLT能逆转上述FFA诱导的胰岛素抵抗现象，使胰岛素(100 nmol/L)刺激的葡萄糖摄取量分别增加77.7%。我们已发现MLT能提高高糖高脂膳食诱导的肥胖大鼠对胰岛素的反应性，大量的文献报道也证实MLT的这一作用[3]。另外，对正常3T3-L1脂肪细胞，MLT并不影响其对葡萄糖的摄取能力。在肥胖Zucker大鼠中，接受长时间光照的大鼠，其体重高于短光周期环境下饲养的大鼠，而这一光照变化所导致的体重差异并不见于瘦的大鼠;MLT能降低中年大鼠的体重，而年轻的成年Wistar大鼠则不受光照或者MLT处理的影响[4-6]。这些资料表明，MLT对体重正常的大鼠并没有作用，它只能改变已经超重大鼠的体重和脂肪含量，而由于肥胖往往伴有代谢的紊乱和胰岛素敏感性的低下。鉴于此，推测MLT在改善代谢紊乱时也有“选择性”，即可能只作用于已经发生了代谢紊乱的动物。因而，在本研究中MLT只是改善了FFA诱导的胰岛素抵抗细胞的胰岛素敏感性，而并不影响正常3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的反应性。

FFA可在胰岛素信号传导的多个位点抑制胰岛素信号传递，降低靶细胞对胰岛素的敏感性，引起骨骼肌和脂肪细胞胰岛素抵抗和糖代谢障碍[5]。Griffin等[7]发现FFA可以增加 IRS-1的丝氨酸(苏氨酸)磷酸化，并因此降低肌肉IRS-1偶连的PI3K活性。而IRS-1偶联PI3K是骨骼肌中胰岛素信号的重要调节物，胰岛素刺激的葡萄糖转运和糖原合成酶的活性均与此酶的激活相关。葡萄糖转运蛋白(GLUT)是细胞转运葡萄糖的载体，在脂肪细胞和肌细胞中为GLUT-4亚型，胰岛素刺激GLUT-4在脂肪细胞和肌细胞的表达以及向细胞膜上的转移，从而促进葡萄糖分子转运进入细胞进行分解或合成糖原。Michal等[8]研究发现葡萄糖转运水平也是FFA诱导胰岛素抵抗的作用位点，因为研究显示高浓度FFA可以直接抑制心肌GLUT-4和过氧化物酶体增生物激活受体-γ(PPARγ)的基因转录的启动。那么，MLT是否通过以上途径调节了脂肪细胞对葡萄糖的摄取呢?我们将作进一步研究。

[1]Hausdorff S F，Fingar D C，Morioka K，et al.Identification of wortmannin sensitive targets in 3T3-L1 adipocytes[J].J Biol Chem，1999，274(35):24677-24684.

[2]Boden，Guenther.Free fatty acids as target for therapy[J].Curr Opin Endocrinol Diabetes，2004，11(5):258-263.

[3]Alonso-Vale M I C，Borges-Silva C N，Anhê G F，et al.Light/dark cycle-dependent metabolic changes in adipose tissue of pinealectomized rats[J].Horm Metab Res，2004，36:474-479.

[4]Sanchez-Mateos S，Alonso-Gonzalez C，Gonzalez A，et al.Melatonin and estradiol effects on food intake，body weight，and leptin in ovariectomized rats[J].Maturitas，2007，58:91-101.

[5]Steven E，Hull RL，Utzschneider K M.Review article mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes[J].Nature，2006，444:840-846.

[6]佘美华，胡小波，邓小健，等.Neu-P11抑制高糖高脂喂养大鼠体重的增长和脂肪的异位沉积[J].中国生化药物杂志，2009，30(3):178-180.

[7]Griffin M E，Marcucci M J，Cline G W，et al.Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade[J].Diabetes，1999，48(6):1270-1274.

[8]Michal A，Chava H，Fabiana B Y，et al.Free fatty acids repress the GLUT4 gene expression in cardiac muscle via novel response elements[J].J Biol Chem，2005，280(41):34786-34795.