抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定

林晓思，许 健，王生育，颜江华

(厦门大学医学院抗癌研究中心，福建 厦门 361000)

双特异抗体可以有效的将效应细胞富集到靶细胞周围，增强对靶细胞的杀伤，因而双特异抗体介导的免疫细胞治疗是一种很有前景的肿瘤治疗手段。CD5是一种泛T细胞(pan T Cell)表面标记，在双特异性抗体介导T细胞对肿瘤靶向治疗的过程中，CD5可以取代CD3和FcR作为双特异抗体在T细胞表面的结合点，并消除这两者和配体交联后引发的副作用[1-2]。另一方面在 T淋巴细胞瘤中由于CD5的表达上调，因此CD5也被选作治疗靶点[3-4]。本文拟采用基因工程手段，构建 scFv anti-CD5/pET22b(+)重组质粒，原核表达重组蛋白。为构建以scFv anti-CD5为构件的双特异抗体以及免疫偶联物提供物质前提，并为其应用于肿瘤的免疫治疗提供基础。

1 材料

菌种 E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α 和质粒pET22 b(+)，Novagen 公司;细胞株 EC304，南京凯基生物技术有限公司;细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，长春藤生物技术有限公司;Pfu DNA聚合酶，天根生物技术有限公司;NcoⅠ和XhoⅠ内切酶、T4DNA连接酶，NEB公司;Ni-NTA agarose，GE公司;HRP标记抗His-tag兔多克隆抗体，北京康维世纪生物技术有限公司;异硫氰酸酯荧光素(FITC)，Amresco公司。引物由上海生工合成。

EPICS XL流式细胞仪，美国 Beckman-Coulter公司。

2 方法

2.1 重组质粒的构建

2.1.1 基因序列与引物设计 从NCBI Genbank里查到DNA序列M90468和M90467，扣除前面66 bp的pelB信号肽序列后得到的即是anti-CD5的重链可变区VH和轻链可变区VL的序列。在VH和VL之间插入linker-(G4S)3编码序列，在VH的5'添加NcoⅠ酶切位点，在VL的3'端添加XhoⅠ酶切位点，并在整个基因两端添加保护碱基序列，并通过E.coli高频率简并密码子取代原始序列中的稀有密码子，设计出的目的基因scFv anti-CD5序列(共计741 bp)，合成10条拼接引物F1-R10，以及一对扩增引物 F11和 R11(表1)。

2.1.2 重组质粒的构建 将F1-R10等10条拼接引物，温育获得基因scFv anti-CD5，温育反应条件为:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，68℃温育2 h;72℃延伸10 min。加入F11和R11扩增目的基因，扩增反应条件为:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min;33个循环后，72℃延伸10 min，对PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定后以NcoⅠ和XhoⅠ酶切PCR产物，回收和纯化酶切产物，在T4连接酶的作用下将其插入到经同种酶切的pET22b(+)中，获得重组质粒并转化到E.coli DH5α中。随机挑选转化子，进行菌液PCR筛选，选择PCR反应产物和理论设计值大小一致的克隆送上海Invitrogen公司测序。

2.2 重组蛋白在E.coli中的表达、纯化与复性

将测序正确的重组质粒scFv anti-CD5/pET22 b(+)转化到 E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落，接种到含终浓度50 μg/mL氨苄西林(Amp)的LB培养液3 mL中，37℃，250 r/min振荡培养过夜;再按1∶100稀释至含终浓度50 μg/mL Amp的LB培养液300 mL 中，37 ℃振荡培养至 A600为0.6 ～0.8;加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1 mmol/L，37℃，250 r/min诱导6 h。包涵体溶解后的上清液，用镍亲和色谱柱纯化，操作过程参照GE公司提供的操作指南进行。纯化后的蛋白对含1%PEG4000、0.4 mol/L 精氨酸的100 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.7)透析复性。

2.3 scFv anti-CD5的 FITC 标记

对0.1 mol/L碳酸盐缓冲液透析后的scFv anti-CD5，浓缩到 1 mL(约 200 μg/mL)，往其中加入1 mg/mL FITC溶液12 μL，置4℃反应4 h，用超滤管4℃离心重悬数次以去除游离的荧光素，测得A280=0.084，A495=0.100，将 scFv anti-CD5-FITC 均分 4份，将最后一次离心得到的穿出液吸出1 mL，平均分为4份。整个过程注意避光。

2.4 流式细胞仪检测scFv anti-CD5的活性

收获对数生长期的细胞，冰冷的PBS(pH 7.4)洗涤2次;4%多聚甲醛溶液重悬并室温固定30 min以上，冰冷的PBS(pH 7.4)复洗2次;血球计数板计数后，调整各种细胞浓度至2.5×105，取细胞1 mL，离心后用细胞封闭液封闭2 h，用冰冷的PBS洗2遍，然后加入等量的scFv anti-CD5-FITC，4℃避光反应12 h，冰冷的PBS(pH 7.4)洗去未结合蛋白 (每步离心条件均为:4℃，1200 r/min，6 min);洗涤5次，加入PBS至1 mL，300目尼龙网过滤后上机检测。

2.5 细胞膜蛋白提取

分别收集EC304、CIK细胞后，冰浴超声破碎，9000 r/min离心10 min，去除未破裂的细胞和细胞核碎片，然后取上清，加入适量体积的solution B，43000 r/min超速离心1 h，即得到细胞的总膜蛋白粗提物。

2.6 Western blotting

取细胞总膜蛋白10 μg上样，10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳，100 mA电流半干转2 h;2%BSA室温封闭2 h，倾去封闭液，将硝酸纤维素膜放入干净的培养皿中，分别加封闭液稀释的scFv anti-CD5，scFv anti-CD5约为 5 μg/mL，4 ℃过夜;TBST洗3次，每次5～10 min，加入1∶1000稀释的 HRP标记抗His-tag兔多克隆抗体，室温放置1.5 h;TBST洗3次，每次5～10 min;DAB显色。

3 结果

3.1 重叠PCR构建scFv anti-CD5

将F1-R10等10条拼接引物，温育获得含基因scFv anti-CD5的混合物，以此为模板，用F11和R11为引物，常规PCR扩增出scFv anti-CD5基因。如图1所示，在泳道2中从100～800 bp之间的弥散状条带为重叠PCR的产物，泳道1为F11和R11扩增拼接产物后得到了两条带，其中一条在740 bp左右，可能是目的基因。纯化产物位于740 bp左右，与理论设计值一致。

表1 引物序列Fig.1 Sequence of primers

图1 scFv anti-CD5基因的构建Fig.1 Gene construction of scFv anti-CD5

3.2 scFv anti-CD5重组子的复筛

基因和载体连接后，转化DH5α感受态细胞，挑取3个单菌落，以F11和R11为上下游引物进行PCR复筛鉴定，1.2%琼脂糖凝胶电泳显示在700～800 bp处均有一特异性亮带(图2)，与理论设计值相符，测序结果进一步证明2号和3号菌落含有序列正确的重组质粒scFv anti-CD5/pET22b(+)的克隆(测序结果略)。

图2 scFv anti-CD5重组子筛选PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析Fig.2 Analysis of PCR product of scFv anti-CD5 recombinant using primers F11 and R11

3.3 融合蛋白scFv anti-CD5在 E.coli BL21(DE3)中的表达

诱导scFv anti-CD5表达后，将菌体裂解，分别收集超声上清、沉淀进行电泳，经过染色、脱色，结果如图3所示。在相对分子质量(Mr)约28000处有一明显的表达带，而未诱导菌没有出现相同的条带，同时观察到目的蛋白绝大部分存在于超声沉淀中，说明融合蛋白在宿主菌中主要以包涵体的形式存在。包涵体处理后，过镍亲和柱纯化，电泳后几乎只出现1条蛋白质条带，说明经亲和色谱纯化到较高的纯度。

图3 蛋白表达形式以及纯化Fig.3 Protein expression analysis and purification.

3.4 流式细胞仪检测scFv anti-CD5的活性

CD5仅在T淋巴细胞及其分化亚群高表达，CIK细胞是T细胞在体外由anti-CD3和IL2诱导分化得到的CD5阳性细胞株[2]。将scFv anti-CD5标记上FITC后，用流式细胞仪检测scFv anti-CD5结合CD5的能力。结果如图4所示，EC304组和CIK组的平均荧光强度分别为1.19和6.83;可见scFv anti-CD5-FITC特异的结合到了CIK上。

图4 流式细胞术检测scFv anti-CD5活性Fig.4 Flow cytometry for cell labeled with scFv anti-CD5-FITC

3.5 scFv anti-CD5结合CD5能力的验证

采用Western blotting的方法进一步分析scFv anti-CD5是否特异的结合到CD5分子上。结果如图5所示，在Mr约67000有条带，这个位置与文献报道的CD5的位置相符[5]，说明得到的 scFv anti-CD5能够识别CD5抗原。

4 讨论

图5 Western blotting分析scFv anti-CD5的抗原结合特异性Fig.5 Western blotting analysis of antigenic specificity of scFv anti-CD5

本研究成功地构建了scFvanti-CD5/pET22b(+)重组质粒，表达的蛋白纯化复性后能够特异的识别CD5抗原。目前常用的CD5抗体多为鼠源性的完整抗体。这些抗体人体内反复使用可引起人体产生人抗鼠抗体反应;完整的抗体Mr大，不易穿透各种屏障;而且它们的Fc段的存在可使其与体内具有Fc受体的非特异组织细胞结合，影响其靶向效果。完整抗体的这3个缺点使之在临床的应用方面大大受到限制，而且用杂交瘤技术生产完整抗体(mAb或bsAb)的成本比较高，不利于大量的制备。反观单链抗体，其免疫原性低、组织穿透能力强，不具有Fc片段，而且可以在原核系统中高效表达，克服了完整抗体的4大缺陷，因此本研究结果有着重要的意义。然而，由于单链抗体只有一个抗原结合位点，因此其结合抗原的能力较弱。本研究的实验结果也印证了这一点，流式细胞术和Western blotting的结果信号都不是很强。通过化学交联或对单链抗体进行多聚化改造，可望增强其亲和力。

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