慢性间歇性低压低氧对丹皮酚抑制大鼠回肠收缩活动的影响*

宋 爽 宋士军 张 翼 于 雷 赵晗洁 吴 婵

慢性间歇性低压低氧（chronic intermittent hypo⁃baric hypoxia，CIHH）是指一定时间间断地暴露于低压低氧环境,而其余时间处于常压常氧环境。研究表明，CIHH可对抗缺血/再灌注引起的心肌损伤，并具有抗心律失常作用[1]。也有报道CIHH可以改变受体的反应性[2]，CIHH有望作为一种治疗手段用于临床。丹皮酚（牡丹酚，paeonol，Pae）是中药牡丹皮和徐长卿中的主要有效成分，具有镇静、抗炎、抗菌、抗脑梗死、抗糖尿病和抗肿瘤等多种药理作用。常用于治疗口腔溃疡、胃病、肝炎、胰腺炎、肠炎、急性阑尾炎等消化系统疾病[3]。CIHH和丹皮酚对消化道平滑肌收缩活动的影响均少见报道。本研究旨在观察CIHH处理前后，丹皮酚对大鼠回肠平滑肌的作用及作用机制的异同点，为临床上应用CIHH和丹皮酚提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 药品及仪器 丹皮酚购自Alfa Aesar公司，使用时用75%乙醇溶解；心得安（propranolol）、阿托品（Atropine）、左旋硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME）、格列苯脲（glibenclamide，Gli）和乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）均购自Sigma公司；吲哚美辛（Indomethacin，Indo）购自Calbiochem公司。其余药物均为国产分析纯。Krebs液（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7,CaCl22.5，MgSO41.2，NaHCO325.0，KH2PO41.2,葡萄糖 11.0，pH 7.4。无钙Krebs液不加Ca⁃Cl2。SQG-4四腔器官浴槽系统（成都仪器厂生产），HSS-1型恒温浴槽（成都仪器厂生产），BL-420E+生物功能实验系统（成都泰盟科技有限公司生产）。

1.2 实验动物 Sprague-Dawlay(SD)大鼠48只，清洁级，250~300 g，雌雄兼有，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：1001002，许可证号：CXK（冀）2008-1-003。

1.3 大鼠离体回肠标本制备 大鼠实验前24 h禁食，自由饮水，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，迅速开腹,从回盲部取出末端回肠6~7 cm，用Krebs液冲洗内容物，然后将其剪成约1 cm的肠段备用。将肠段置于平滑肌槽内用Krebs液浸浴，温度调节为（37.0±0.5）℃恒温,持续通入95%O2+5%CO2混合气体；肠段通过张力换能器与BL-420E+生物功能实验系统连接并记录收缩活动，加前负荷1.0 g，平衡1 h，每20 min换液1次，待肠段自主收缩活动稳定后开始加药。

1.4 实验分组 48只大鼠随机分为CIHH组和正常氧（CON）组，每组24只，每只大鼠可取得回肠段5~6段，每组动物中的每个肠段均来自不同的大鼠；CIHH组置于低压氧舱接受28 d模拟5 000 m海拔高度的低压低氧处理，每日6 h，自由食水，每周监测体质量变化。CON组除不接受慢性低压低氧处理之外，其余与CIHH组动物相同。

1.4.1 CIHH对丹皮酚抑制大鼠回肠平滑肌收缩活动的影响 在CON和CIHH组中随机抽取不同大鼠的1个肠段，8个肠段为一小组，CON和CIHH组各分为丹皮酚组和对照组，丹皮酚组以5 min为间隔加入丹皮酚，使灌流槽Krebs液中丹皮酚累计浓度分别为20、40、80、160、320和640 mg/L。对照组加入与丹皮酚等体积的75%乙醇。记录各时间点收缩活动的幅度、频率和张力，并计算活动力（活动力=幅度×频率）[4]。将各指标换算成占给药前相对应指标的百分数。以活动力为指标，用Logit法[5]计算CON和CIHH组的半数抑制浓度（IC50）。

1.4.2 回肠平滑肌几种与钙有关的收缩活动的测定 分组方法同1.4.1丹皮酚组加入150 mg/L丹皮酚，对照组加入等体积乙醇。对ACh引起的细胞内Ca2+和外Ca2+性收缩的影响参照文献[6]的方法进行测定。参照文献[7]的方法分别测定库容性钙通道开放引起的收缩（SOCE诱发的收缩）和高K+诱发的电压门控钙通道开放引起的收缩。

1.4.3 各种药物对丹皮酚作用的影响 在CON和CIHH组中随机抽取不同大鼠的1个肠段，8个肠段为一小组，CON和CIHH组各分为对照组、心得安组、L-NAME组、格列苯脲组和吲哚美辛组，待肠段收缩活动稳定后，各组分别加入蒸馏水、心得安10 μmol/L、L-NAME 0.3 mmol/L、格列苯脲5 μmol/L和吲哚美辛10 μmol/L，10 min后加入丹皮酚150 mg/L，记录收缩幅度并计算占给药前收缩幅度的百分数。

1.5 统计学处理 所有数据分析均由SPSS 13.0完成。用均数±标准差（x ±s）的形式表示，两组间均值比较应用t检验，多组间均值比较应用单因素方差分析和Dunnett-t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 CIHH对丹皮酚抑制大鼠回肠平滑肌收缩活动的影响 丹皮酚从幅度、频率、张力和活动力方面均显著抑制CON和CIHH大鼠回肠平滑肌的收缩活动。与对照组相比丹皮酚多个剂量在幅度、频率、张力和活动力方面的差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1、2。以活动力为指标计算IC50分别为65.13 mg/L和135.74 mg/L。CIHH明显减弱了丹皮酚对大鼠离体回肠的抑制作用，与CON相比，当丹皮酚剂量为40~640 mg/L时，在幅度和活动力方面差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表3。

2.2 丹皮酚对大鼠回肠平滑肌几种与钙有关的收缩活动的影响 在CON，丹皮酚显著抑制了ACh引起的细胞内外Ca2+性收缩、SOCE诱发的收缩和高K+诱发的收缩，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。在CIHH，丹皮酚显著抑制了ACh引起的细胞外Ca2+性收缩和高K+诱发的的收缩，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；而对细胞内钙性收缩和SOCE诱发的收缩无显著影响（P>0.05），见表4。

2.3 各种药物对丹皮酚作用的结果 在CON，心得安组、L-NAME组和吲哚美辛组可部分阻断丹皮酚对回肠平滑肌收缩幅度的抑制作用，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），见表5，而格列苯脲组对丹皮酚的作用无影响（P>0.05）。在CIHH，L-NAME组和吲哚美辛组可部分阻断丹皮酚对回肠平滑肌收缩幅度的抑制作用，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），而心得安组和格列苯脲组对丹皮酚的作用无显著影响（P>0.05），见表5。

表1 丹皮酚对CON大鼠回肠自发收缩活动的影响 （n=8，%，x ±s）

表2 丹皮酚对CIHH大鼠回肠自发收缩活动的影响 （n=8，%，x ±s）

表3 丹皮酚对CIHH大鼠回肠平滑肌收缩活动影响的统计量 （t）

表4 丹皮酚对大鼠回肠平滑肌几种与钙有关的收缩活动的影响 （n=8，x ±s，%）

3 讨论

本研究结果表明，丹皮酚从幅度、频率、张力和活动力4个方面抑制了大鼠离体回肠的收缩活动，CIHH预处理后显著减弱了丹皮酚对大鼠离体回肠的抑制作用。

表5 各种药物对丹皮酚作用后回肠平滑肌收缩幅度的影响 （n=8，x ±s，%）

消化道平滑肌细胞膜上存在着电压操纵性钙通道（voltage-operated Ca2+channel，VOCC）[7]，高钾可使膜电位去极化，诱导VOCC开放而引起平滑肌收缩。丹皮酚抑制了正常氧和CIHH大鼠高钾诱导的回肠平滑肌收缩，提示丹皮酚抑制回肠收缩的机制之一是抑制了VOCC的开放。

钙库操纵性钙通道（store-operated Ca2+channel，SOCC）属于受体操纵性钙通道的一种，SOCC主要由内质网中Ca2+量调控，在内钙耗竭情况下打开SOCC，进而导致平滑肌收缩[7]；丹皮酚在内钙耗竭、M受体被阻断的情况可以抑制正常氧大鼠回肠的收缩活动，提示丹皮酚可能抑制了细胞SOCC的开放而抑制回肠收缩；但是在CIHH大鼠无此作用，提示CIHH能够取消丹皮酚的此作用。

NO可激活鸟苷酸环化酶，从而提高细胞内cGMP水平，降低Ca2+浓度使平滑肌舒张，抑制胃肠运动,也可能通过非cGMP依赖途径引起平滑肌舒张[8]，L-NAME是NOS的抑制剂，本实验中L-NAME可部分阻断丹皮酚对正常氧和CIHH大鼠回肠收缩活动的抑制作用，提示丹皮酚可能通过刺激NOS的活性而增加细胞内NO的含量进而抑制回肠收缩。

激动β2受体可使回肠平滑肌细胞舒张[9]，心得安是β受体的阻断剂。本实验中心得安部分阻断了丹皮酚对正常氧大鼠回肠平滑肌收缩活动的抑制作用，提示丹皮酚激动了平滑肌的β2受体而抑制回肠收缩；但是CIHH抑制了心得安对丹皮酚的部分阻断作用，说明CIHH可以通过降低β受体反应性，来对抗丹皮酚的此项作用，这与以往的报道相符[2]。

前列腺素（prostaglandin，PG）族的前体花生四烯酸在环氧合酶（COX）等的作用下可以形成PGE2和PGD2等物质，PGE2可以通过作用于EP1受体使肠肌收缩，而PGD2可以通过作用于DP受体使肠肌舒张[10]。吲哚美辛是环氧合酶的非特异性抑制剂。本实验中吲哚美辛可部分阻断丹皮酚对CON和CIHH大鼠回肠平滑肌的抑制作用，提示丹皮酚可能改变了COX的活性而促进了具有舒张作用的PG的合成或释放进而抑制回肠收缩。

CIHH预处理减弱了丹皮酚对大鼠离体回肠的抑制作用，其机制可能是CIHH通过使受体和离子通道敏感性下降实现的；本研究也发现CIHH处理后取消了丹皮酚的抑制内钙释放、抑制库容性钙内流和激动β2受体作用；至于CIHH处理后为什么改变了离子通道和受体对丹皮酚的反应性及临床意义有待进一步探讨。

[1]张翼，杨黄恬，周兆年.间歇性低氧适应的心脏保护[J].生理学报,2007,59(5):601-613.

[2]王莹萍，布会敏，王妹玲，等.慢性间歇性低压低氧对家兔窦房结肾上腺素能受体反应性的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(3)：435-439.

[3]杨正生，彭振辉，姚青海，等.丹皮酚的药理作用研究进展[J].中国药物与临床，2011，11(5)：545-547.

[4]谢燕，玄振玉，于莉，等.舒经克痛软胶囊对大鼠子宫活动的影响[J].中国中药杂志，2008，33(12)：1466-1469.

[5]刘昌孝，孙瑞元.药物评价实验设计与统计学基础[M].北京：军事医学科学出版社,1999：31-32.

[6]宋士军,李芳芳,徐瑛,等.金银花和黄芩对家兔小肠平滑肌收缩和电活动的影响[J].中国应用生理学杂志,2009,25(3)：344-348.

[7]柯道平,周华,李忠稳,等.库容性Ca2+内流介导大鼠远端结肠平滑肌收缩[J].中国药理学通报,2006,22(3)：344-348.

[8]Rosa S,Maria GZ,Flavia M.Nitric oxide induces muscular relax⁃ation via cyclic GMP-dependent and-independent mechanisms in the longitudinal muscle of the mouse duodenum[J].Nitric Oxide,2003,8(1)：48-52.

[9]白波，高明灿.生理学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2010：227-228.

[10]徐红,孙宏斌.前列腺素受体及相关药物的研究进展[J].中国药科大学学报，2010,41(5)：385-394.