日本薯蓣脱毒培养及离体高效快繁体系的建立

解晓红，陈 丽，裴 蕾，李江辉，李 波，解红娥，武宗信

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

日本薯蓣（Rhizoma Dioscoreae）为薯蓣科植物，属多年生缠绕草本，我国除少数热带地区外，几乎各地都有种植。薯蓣块茎药用价值很高，被医学家称为“理虚之要药”，“滋补药中的上品”。《本草纲目》认为，薯蓣能“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎，润皮毛”。薯蓣营养价值丰富，富含粗蛋白、氨基酸、维生素、淀粉和糖等[1]。日本薯蓣外形粗壮，通体笔直，均匀美观，产量高，我国每年出口到日本、韩国的干、鲜货可达10万t以上，而且供不应求。但由于多年的传统种植，近年来日本薯蓣品种退化、病毒为害严重，表现症状为叶色失绿、花斑叶、叶畸形；地下块茎明显变小、畸形，产量下降，品质不高，严重时整株矮化，生长缓慢，甚至死亡。目前，大田中已发现的病毒有山药坏死花叶病毒（Chineseyam necroticmosaicvirus）、山药绿色斑驳病毒（Yam green-bandingvirus）、日本山药花叶病毒（Japanese yammasaic virus）、马铃薯Y病毒（Potato Virus Y）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf rollvirus）、马铃薯A病毒（Potato Virus A）、马铃薯 M病毒（Potato VirusM）、马铃薯 S病毒（Potato Virus S）和马铃薯X病毒（Potato Virus X）等[2-3]。目前，在无任何特效药剂防治病毒病的情况下，利用组织培养技术建立薯蓣脱毒培养和离体高效快繁技术体系，是日本薯蓣去除病毒、恢复种性、增加产量、提高品质的最佳途径[4-11]。

本研究通过组织培养手段对日本薯蓣进行脱毒及快繁技术研究。

1 材料和方法

1.1 供试材料

日本薯蓣植株由山西省闻喜县中药材种植基地提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获得 切1 cm左右日本薯蓣茎段，用75%乙醇浸泡30 s，再用不同消毒剂消毒，筛选合适的消毒剂及用量。消毒茎段接种到MS附加不同激素培养基上进行培养，获取无菌苗。

1.2.2 茎尖培养 在无菌条件下，切取日本薯蓣无菌苗0.2～0.4mm茎尖，每个茎尖带2个叶原基，然后转入MS附加不同外源激素的培养基中进行培养。每瓶接种1个茎尖，接30瓶。90 d后统计结果。

1.2.3 电镜观测法检测脱毒茎尖苗 将待测茎尖苗汁液滴在覆膜铜网上制作样本，电镜观测到病毒质粒的为带毒苗。

1.2.4 多芽体诱导进行快繁 将茎尖形成的丛生小苗，切成带有1个腋芽的茎段，接种到培养基上。40 d后统计多芽体数和生长状况。

1.2.5 试管苗快繁培养 将多芽体切成单芽接种到培养基。40 d后统计苗高、叶片数、生根数。

1.2.6 试管苗移栽 薯蓣试管苗长至5～6片叶时进行移栽。

试验中，琼脂0.7%，pH值为6.0，光强2000～5000 lx，光照时间12h/d，培养温度（28±1）℃。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂对无菌苗培养的影响

取自大田的外植体含有大量的杂菌，消毒后接种才能长出无菌苗。设计不同用量和消毒时间，分别使用HgCl2和NaClO对来自大田的外植体进行消毒比较试验，结果（表1）表明，用0.1%HgCl2消毒6～8min效果好，污染率控制在20%以下，成活率达80%～90%；用0.1%HgCl2消毒时间超过10min时，因HgCl2杀伤力强，消毒后不易消除，容易杀伤植物组织，死亡率增大；用0.1%HgCl2消毒小于 6 min或用 0.05%HgCl2时，茎段苗成活率虽提高，但难以消除顽固性的杂菌，污染率会增加。用NaClO消毒，污染率较高，灭菌效果不理想。消毒好的日本薯蓣茎段苗接种到MS附加不同激素培养基上，可获得无菌苗。

表1 消毒剂用量及消毒时间对茎段苗成活率的影响

2.2 不同外源激素对日本薯蓣茎尖存活率和芽分化的影响

选择生长健壮的薯蓣无菌苗，在4×10 X解剖镜下切取0.2～0.4mm茎尖，分别放入MS附加不同质量浓度6-BA，NAA，IBA培养基中，茎尖均能启动细胞分裂，5～7 d茎尖开始膨大变绿或脱分化形成半透明颗粒状愈伤组织，90 d后诱导出的愈伤组织再分化形成高约0.5 cm小苗（表2）。

表2 不同外源激素对茎尖分化的影响

由表2可知，（1）单一6-BA就能诱导茎尖成苗，随6-BA质量浓度（0.25～1.0mg/L）增大，茎尖存活率和分化出芽数目增加，但较高质量浓度（1.5mg/L）反而不利于茎尖的成活和芽分化；（2）6-BA配合较高质量浓度的NAA有利于茎尖分化、长出多芽和有利于芽的生长，0.5mg/L 6-BA＋1.5mg/LNAA成苗率达到 100%；（3）在6-BA质量浓度一定的情况下，添加不同质量浓度IBA，对茎尖成苗差异不明显，但分化出的芽生长较快，愈伤产生量较小。

2.3 电镜观测法检测脱毒茎尖苗

将待测茎尖苗汁液滴在覆膜铜网上制作样本，在电镜观测到病毒颗粒的为带毒苗。去除检测出的带毒苗，剩余的即为脱毒苗，用于进一步的脱毒快繁。如果茎尖苗的含病毒颗粒较多，可以再次在4×10X解剖镜下切取0.2～0.4mm茎尖，进行培养后检测。如此重复2～3次可以使脱毒的效果提高到90%以上。

2.4 不同激素配比对薯蓣茎段快繁多芽体形成的影响

将脱毒的茎尖苗切成带1个芽的茎段接种在不同培养基中，其均能分化成多芽或苗（表3）。

表3 不同激素配比对茎段快繁多芽体形成的影响

接种40 d后的统计结果表明，在茎段诱导多芽体形成过程中，6-BA起着主导作用。在NAA质量浓度一定的情况下，随6-BA浓度增加，多芽体形成增多，如A，B，C培养基中，芽体平均数由4个增加到4.8个，且芽体生长健壮。在6-BA质量浓度一定时，随NAA质量浓度增大，形成芽个体数减少，且芽偏白，不利于后期生长。如A，D，E培养基中，芽体平均数由4.0个降至1.9个。在MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA中，形成的多芽体数最多，达到4.8个，芽体呈绿色，芽体高2～4 cm；在MS＋2.0mg/LKT＋0.2 mg/LNAA中，芽体的分化率虽比较低，但芽体大，苗壮。在MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA基础上添加IBA对诱导薯蓣多芽体形成没有太大影响。结果表明，日本薯蓣茎段快繁多芽体诱导以MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA为佳，繁殖系数大，芽分化和生长状态良好。

2.5 不同激素配比对薯蓣试管苗生根和生长的影响

将多芽体切成单芽，接种到生根培养基中，40 d后，所有培养基均长出嫩茎，并长出新叶，但能生根且生长势强的只有2种培养基。在试管苗生长过程中，较低质量浓度的NAA明显能促进生根；6-BA和NAA组合对丛生芽的形成和生长有利，而对生根的效果不明显，且极易促进愈伤的形成，其中6-BA的存在明显促进了芽的生长和分化；KT和NAA组合培养基中芽分化较少，但试管苗生长较好，且生根效果明显；KT/NAA的比值越大，试管苗长势越壮，根系发育越好，最终选择MS＋2.0mg/L KT＋0.02mg/LNAA的效果最好；MS＋1.0mg/LKT＋0.2mg/LNAA虽然生根条数最多，但试管苗长势不好（表4）。消毒大田茎段产生无菌苗也是接种到这2种培养基上效果较好。

表4 不同激素配比对试管苗生长和生根影响

2.6日本薯蓣试管苗的移栽

当薯蓣试管苗长至5～6片叶时进行移栽，在培养间28℃左右的条件下，打开瓶盖，逐渐降低湿度，进行炼苗，2～3 d后洗净试管苗根部培养基，移栽到装有沙、蛭石、泥炭土混合基质的营养钵或移栽盘中，用800～1 000倍移栽液浇灌，并采取适当的保湿措施，移栽成活率达85.5%。同时，移栽时期以春、秋、冬三季为好，植株成活率高；夏季由于高温高湿，细菌繁殖速度较快，容易造成污染，移栽成活率降低。

3 结论和讨论

本研究得出，标准的脱毒快繁程序为：消毒的茎段在培养上产生无菌苗，切取无菌苗0.2～0.4 mm茎尖接种到MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.5 mg/LNAA，进行病毒检测并剔除带毒茎尖苗，脱毒茎段接种到MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA进行诱导多芽体快繁，多芽体分割成单芽在MS＋2.0mg/LKT＋0.02mg/LNAA上进行诱根和生长，生根的再生植株移栽到大田。

本试验只是确定了脱毒的流程，获得了移栽到大田的脱毒植株，在生产上的应用和表现以及推广工作还有待于进一步研究。

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