GDF-8干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞最佳条件研究
2011-04-30岳文斌张晓强张春香
靳 辉,黄 洋,岳文斌,张晓强,张春香
(山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801)
1997年,美国John Hopkins大学的McPherron等[1]从小鼠骨骼肌cDNA文库中发现了一种新的生长分化因子(Growthand Differentiation Factor,GDF),该因子只有1个可读框,可编码376个氨基酸,具有转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)家族的典型特征,但通过与TGF-β家族其他成员比较,其与TGF-β家族其他成员的同源性很低,最高仅为45%,因而列为TGF-β家族的一类因子——GDF-8。就C端而言,GDF-8基因在不同物种间十分保守,大鼠、人、猪、鸡、火鸡、小鼠的同源性达100%[2]。
GDF-8是一种对骨骼肌生长具有负调控作用的重要细胞因子,GDF-8基因的突变或缺失会导致肌肉细胞的增生和肌纤维的肥大,该基因敲除的动物具有生长速度快、肌肉含量高、脂肪含量少的特点[1]。利用基因敲除技术研究GDF-8功能时发现,敲除GDF-8基因的小鼠骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上,但在其他生长发育性状上没有发现任何表现型的差异[1]。GDF-8基因自然突变的双肌牛——比利时蓝牛[3],其肌肉数量较一般品种多20%左右,而且肉质鲜嫩,极大地提高了饲料转化效率。因此,建立敲除GDF-8基因的转基因动物具有广阔的应用前景。
本试验采用脂质体转染法,用红色荧光蛋白(RFP)标记的GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞,探索其最佳转染条件。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 表达载体与菌种 红色荧光蛋白标记的GDF-8基因干扰质粒和大肠杆菌DH5α为山西农业大学动物科技学院遗传育种与繁殖实验室保存。
1.1.2 试剂 DMEM/F12(Boster),胎牛血清,胰蛋白酶(Solarbio),双抗(Sigma),LipofectamineTM2000(invitrogen),Opti-MEM(GIBCO)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养液的配制 在DMEM/F12中添加10%胎牛血清(FBS)、1%双抗所构成的培养基(简称基本培养基)用于绵羊耳成纤维细胞的原代培养和传代培养。在DMEM/F12中添加10%FBS,所构成的培养基(简称无抗培养基)用于GDF-8基因干扰质粒的转染。
1.2.2 靶细胞的培养 取1周龄绵羊新鲜耳组织,采用组织块贴壁培养法进行原代、传代培养和冻存,建立绵羊耳成纤维细胞系[4-7],为脂质体介导的GDF-8基因干扰质粒转染提供靶细胞。
1.2.3 脂质体法介导转靶细胞 将传至4代已经纯化的耳成纤维细胞接种于96孔板中,每孔细胞数为10 000个。待细胞汇合至70%~80%时,将基本培养基换为无抗培养基。更换培养基24 h后,细胞汇合度已达到90%,按如下步骤进行GDF-8基因干扰质粒的转染:(1)将不同量的质粒 DNA(0.1,0.2,0.4,0.6 μg) 和不同量的LipofectamineTM2000(0.1,0.5,1.0,1.5 μL)分别稀释于25μL的Opti-MEM中。然后,将稀释好的不同量质粒DNA和不同量的LipofectamineTM2000两两混合,室温搁置20min,构成转染液,加入一个培养孔中,每个组合重复3个孔,12 h后更换为基本培养基。48 h荧光倒置显微镜下检测每个组合表达红色荧光蛋白的阳性细胞数,用以筛选最佳质粒DNA用量和最佳LipofectamineTM2000用量。检测时每个转染处理组随机选取5个视野,检测表达红色荧光蛋白的阳性细胞数,计算每个处理组的阳性细胞数平均值。(2)用筛选出的最佳质粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量构成转染液,分别于 3,6,12,24,48 h 后更换为基本培养基,每个时间重复3次。48 h荧光倒置显微镜下检测不同转染时间的阳性细胞数,用以筛选最佳转染时间。检测方法同(1)。
2 结果与分析
2.1 转染的最佳质粒DNA用量和脂质体用量
试验结果表明,当DNA用量为0.4μg,脂质体用量为1.0μL时,不同时间观察转染效率均较高。不同时间观察的转染效果如图1所示。
48 h计算5个视野平均阳性细胞数,结果如表1所示。
2.2 转染的最佳时间
用筛选出来的最佳质粒DNA量0.4μg和脂质体量1.0μL转染绵羊耳成纤维细胞,计算不同时间后的阳性细胞数,结果表明,转染时间为6 h时,可以获得较高的转染效率(表2)。
表1 48 h不同质粒DNA量和不同脂质体量转染5个视野平均阳性细胞数 个
表2 不同转染时间对转染效果的影响
3 讨论
3.1 红色荧光蛋白(RFP)和阳离子脂质体法
本试验采用红色荧光蛋白(RFP)标记GDF-8基因干扰质粒,RFP在靶细胞内表达,可以直接在荧光倒置显微镜下观察,便于识别转染阳性细胞,因此,RFP作为一种理想的标记物应用于转基因领域。目前,阳离子脂质体法常作为转染外源基因的手段[8]。研究发现,多种脂类可以在合适的条件下形成小的单层阳离子脂质体,这些脂质体的表面带有正电荷,能被DNA的磷酸根所吸附,同时也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,通过细胞融合或胞吞作用使脂质体和DNA复合物进入细胞质,最终进入细胞核并使外源基因整合到染色体中进行基因的表达[9]。由于不同类型的细胞吸收大小各异颗粒的能力不尽相同,针对不同细胞类型以及所介导的核酸(DNA,RNA或核苷酸),选择合适的脂质体是十分重要的。LipofectamineTM是一种新型脂质体,其独特的精胺基团强正电子头部可以同时与带负电的DNA和细胞形成复合物,大大提高了转染效率。LipofectamineTM作为载体在体内外基因转染的研究中已有很多文献报道[10]。该方法具有高效、简便、对细胞损伤小和容易重复等优点。
3.2 影响转染效果的各种因素
本试验探讨了LipofectamineTM2000介导的GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件。首先在转染前24 h,将含抗生素的基本培养基更换为无抗生素的无抗培养基,因为在抗生素存在的情况下不利于转染。另外,试验探索了转染时的最佳质粒DNA和脂质体用量以及最佳转染时间,由于不同细胞达到最佳转染效果时所用的DNA量和脂质体量是不同的。由本试验结果可知,当脂质体量一定时,转染效率会随DNA量的增加而增加,但有一个最大值,超过这个最大值时转染效率降低。当DNA量一定时,转染效率会随脂质体量的增加而增加,但也有一个最大值,超过最大值后转染效率也会降低。因为高浓度的脂质体对细胞有毒性,会导致细胞萎缩、死亡。此外,转染时间一定程度上也影响着转染效率的高低。以上结果表明,DNA和脂质体用量以及转染时间会影响转染效率,欲提高转染效率还有待进一步研究。
4 结论
用GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件为:DNA用量为0.4μg,脂质体用量为1.0μL,转染时间为6 h。
[1] McPherron AC,LawlerAM,Lee SJ,etal.Regulation ofskeletal musclemass in mice by a new TGF-βsuperfamilymember[J].Nature,1997,387(6628):83-90.
[2] Alexandra CMcPherron,Se-Jin Lee.Doublemuscling in cattle due tomutations in themyostatin gene[J].Proc Natl Acad Sci,1997,94(23):1457-1461.
[3] Grobet L,Mani I J,Poncelet D,et al.A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle[J].NatGenet,1997,17(1):71-74.
[4] 李桂芳,李岩,赵宗胜,等.绵羊耳成纤维细胞的体外培养[J].中国草食动物,2003,23(4):5-7.
[5] 万发春,刘晓牧,宋恩亮,等.用于保种的蒙山牛耳成纤维细胞的培养研究[J].华北农学报,2009,24(增刊):109-112.
[6] 王亮,刘婷婷,彭涛.荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究[J].黑龙江畜牧兽医,2006(5):9-11.
[7] 关伟军,马月辉.小尾寒羊耳组织成纤维细胞系的建立与生物学特性研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(5):511-516.
[8] Raniere R Oliveira.Effectiveness of liposomes to transfect livestock fibroblasts[J].GMR,2005,4(2):185-196.
[9] 胡义德,高铺.Fugene-6,一种介导体外真核细胞高效率基因转染的新方法[J].免疫学杂志,2001,17(2):138-140.
[10] Madry H,Reszka R,Bohlender J,et al.Efficacy of cationic liposome-mediated gene transfer tomesangial cells in vitro and in vivo[J].JMo1Med,2001,79(4):184-189.