皖北地区鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏实验

信阳农业高等专科学校 吴海港

信阳职业技术学院 张文建

华中农业大学动物医学院 王春梅

鸡大肠杆菌病是由致病性血清型的大肠杆菌引起的多种疾病的总称。在临床上可表现为脐炎、败血症、肉芽肿、全眼球炎、气囊病、腹膜炎、输卵管炎等（刘振湘和姚卫东，2008）；还常常与病毒和其他细菌性疾病并发，造成鸡群的高死亡率，给养禽业造成严重经济损失，为了解皖北地区鸡肺脏中大肠杆菌的血清型及药敏性，以便有效地开展预防和治疗工作，本试验进行了鸡肺脏大肠杆菌的分离、血清型鉴定及药敏实验。

1 材料与方法

1.1 材料 病料于2009年1～9月，从皖北地区界首、太和、临泉、亳州等10个县的42家肉种鸡、肉仔鸡、蛋种鸡、蛋鸡场采取；大肠杆菌标准血清由中国兽药监察所提供；试验用小白鼠由华中科技大学同济医学院提供，体重15～25 g；雏鸡购于湖北农科院SPF鸡场；标准菌株购于中国兽药监察所；药敏试纸购于杭州药物研究所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离鉴定 无菌采取具有败血症、心包炎、肝周炎等病理变化的病死鸡心血、肝脏、脾脏，分别接种于普通肉汤、普通琼脂、血液琼脂、麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂培养基上，37℃培养24 h，挑选麦康凯琼脂平板上砖红色菌落接种普通琼脂斜面进行纯培养，培养后胶塞密封，置4℃冰箱保存备用，同时另挑选单个菌落涂片革兰氏染色，进行菌体形态和染色特征的观察。

1.2.2 生化鉴定 取M.C琼脂平板上粉红色单菌落接种于普通肉汤，于37℃培养18 h，按常规方法进行糖类发酵试验及生化反应（陆承平，2007）。

1.2.3 致死性试验 选取体重15～25 g健康小白鼠和10日龄雏鸡各105只，分别随机分组，每组3只，试验组小白鼠腹腔接种24 h肉汤培养物0.2 mL/只，试验组雏鸡肌肉注射24 h肉汤培养物0.4 mL/只，对照组分别用同样方法接种灭菌生理盐水。观察发病和死亡情况、剖检变化，并进行细菌分离。

1.2.4 血清型鉴定 经分离培养、形态特点和生化试验鉴定为大肠杆菌后，再用普通琼脂进行纯培养（37℃、18 h），然后用少量5 mL/L石炭酸生理盐水将菌苔洗下，制成浓稠菌悬液，经过121℃高压2 h，破坏其K抗原，冷却后取一铂金耳与血清（5～10倍稀释）在玻板上混匀，如0.5 min内出现明显凝集者为阳性反应，同时以菌悬液与生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象（夏业才和潘松年，1991）。

1.2.5 药敏实验 按药敏纸片说明书进行操作。

2 结果

2.1 细菌分离 在普通琼脂平皿板上长出表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起，中等大的菌落，在血液琼脂平板上长出菌落较大，边缘整齐，并有隆起的灰白色菌落，多数不溶血。在麦康凯琼脂平板上，形成中等大小的砖红色菌落，在伊红美蓝琼脂平板上，形成带有金属光泽的紫黑色小菌落。在肉汤培养基37℃培养24 h后，呈均匀混浊，管底有淡白色黏稠沉淀，管壁液面有菌环。

2.2 染色镜检 病料及培养物涂片染色镜检均可见两端钝圆，多数散在排列，革兰氏阴性短杆菌。

2.3 生化鉴定结果 34株致病性大肠杆菌的生化试验结果见表1。从表1可以看出各株均能在三糖铁培养基上产酸产气使培养基变黄，均不产生H2S。在发酵葡萄糖、V-P试验、M-R试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验等常规生化试验结果完全符合大肠杆菌的生化特征，但在某些糖、醇的常规生化试验结果出现了一些差异。

表1 各菌株的生化鉴定结果

2.4 致死试验结果 试验动物接种后连续观察8 d，小白鼠试验结果为25株能全部致死小白鼠，4株部分致死，5株不能致死小白鼠。剖检死亡鼠，心外膜出血，肝肿胀，发黑或出血。雏鸡试验结果为23株能全部致死雏鸡，5株部分致死，6株不能致死雏鸡，剖检死亡雏鸡，表现为纤维素性心包炎、心包积液，肝周炎、肝表面被一层薄膜状纤维素性渗出物覆盖，气囊炎。从死亡小白鼠和雏鸡肝脏、腹水、脾脏回收菌的形态染色，生化特性与接种菌一致。

2.5 血清型鉴定结果 从10个县市共分离34株大肠杆菌，除2株未能定性外，共出现10种血清型，结果见表2。从表2可以看出，从鸡肺脏中分离的大肠杆菌以 O2、O78、O26、O22、O1为主， 这 5种血清型合计菌株26株，占定性菌株的80.4%。

表2 32株致病性大肠杆菌的血清型

2.6 药敏实验 结果见表3，分离的大肠杆菌对强力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感，对氧氟沙星、恩诺沙星、新霉素、氨苄青霉素中度敏感，对环丙沙星、利福平、氟哌酸、链霉素、红霉素、土霉素不敏感。

表3 34株大肠杆菌对14种抗生素的药敏实验结果

3 讨论

3.1 血清型鉴定 结果表明，34株鸡致病性大肠杆菌的血清型比较复杂，不同来源的大肠杆菌血清型差异较大，同一来源的菌株O血清型也多不相同。对皖北地区10个县市42个鸡场中病鸡肺脏中分离的大肠杆菌血清型以 O2、O78、O26、O22、O1为主。

3.2 大肠杆菌药敏试验 此次分离的大肠杆菌对强力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感，而对环丙沙星、利福平、氟哌酸、链霉素、红霉素、土霉素不敏感。研究表明，大肠杆菌对环丙沙星的耐药性为56.25%，对卡那霉素、新霉素和庆大霉素较敏感（Zhou等，2009；刘吉山等，2000）。邹玲等（2007）报道，大肠杆菌对环丙沙星的耐药性达81.8%，而本试验分离的大肠杆菌对环丙沙星、利福平、氟哌酸的耐药性较高，可以看出近几年大肠杆菌对氟喹诺酮的耐药性有增高趋势。这种耐药性的出现可能与菌株长期处于环境中抗生素的选择性压力及耐药基因通过染色体或耐药质粒在菌群间的广泛传播或扩散有关（Prats等，2000）。最近几年家禽养殖业迅猛发展，由于缺乏养殖业方面的知识，在饲料添加剂及治疗中常盲目使用抗菌药物，导致许多耐药性菌株产生。大肠杆菌的血清型繁多也是产生耐药性的原因之一（许兰菊等，2004），在选择抗菌药物上建议考虑采取联合用药、交叉用药、轮换用药的方式，一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用，增加疗效；另一方面可以避免细菌长期与某一种药物接触，减少产生耐药性几率。由于大肠杆菌的血清型分布地区差异比较大，临床用药的差异等因素，使得各地区、各养殖场大肠杆菌的耐药谱差异很大（刁有祥等，2002）。因此，定期对分离菌株进行抗生素敏感性的监测，对有效防治养鸡场细菌性疾病有着重要的意义。

[1]刁有祥，李久芹，陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2002，24（1）：21 ～23.

[2]刘吉山，沈志强，李峰.鸡大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验 [J].养禽与禽病防治， 2000，2：190.

[3]刘振湘，姚卫东.畜禽传染病[M].北京：中国农业大学出版社，2008.266～228.

[4]陆承平.兽医微生物学与免疫学[M].北京：中国农业出版社，2007.98～101.

[5]夏业才，潘松年.禽大肠杆菌的研究一致病性大肠杆菌血清型鉴定[J].中国兽药杂志，1991，25（4）：1 ～2.

[6]许兰菊，张书松，潘学营.河南省部分地区鸡源致病性大肠杆菌生物特性的研究[J].中国家禽，2004，26（11）：14 ～15.

[7]邹玲，唐栋，刘文华.鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2007，34（2）：119 ～121.

[8]Prats G，Mirelis B，Llovet T.Antibiotic resistance trends in enteropathogenic bacterial isolated in 1985-1987 and 1995-1998 in Barcelona[J].Antimicrob Agents Chemother，2000，44：1140 ～1145.

[9]Zhou Zhi-hui，Gao Bo，Wang Sheng-zhi，et al.Efects of different preservation methods on activity of recombinant E.coli[J].Animal Husbandry and Feed Science，2009，1（6/7）：16 ～18.