暗紫贝母愈伤组织和不定芽诱导研究

张波 ，李军立，李玉锋 *，何洋， 刘震东， 谢紫莹

（1.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039；2.成都中医药大学，四川 成都610075；3.成都国嘉制药，四川 成都610036）

暗紫贝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）为百合科药用植物，其干燥鳞茎，有清热润肺、化痰止咳的功效，主治肺热燥咳、咯痰带血、痰多胸闷等症[1]。由于暗紫贝母生长环境特殊，喜寒凉气候，野生分布于海拔3200～4500m的高山高原草地上，低于海拔3000m就不能生长，很难人工引种栽培，加之其生长周期长，产量很少.，因此价格昂贵，且过度依赖于野生资源[2-4]。暗紫贝母鳞茎离体培养，有利于野生暗紫贝母的资源保护和开辟药材资源新途径，实现中药的现代化进程。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

暗紫贝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）由四川省国嘉制药新荷花药材种植基地提供并鉴定。其他常见试剂均为分析纯，成都科龙化工试剂厂。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌材料的获得 取暗紫贝母鲜鳞茎，先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干，然后用70%的乙醇浸泡1min，灭菌滤纸吸干，最后用0.1%的HgCl2浸泡消毒10min，无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干。鳞茎切成约0.5cm的块[1,2,5]。

1.2.2 外植体接入不同浓度配比的培养基 在无菌操作条件下，将上述块状鳞茎接种到pH5.8，蔗糖3%，VC0.1 g/L，附加 NAA+6-BA不同配比浓度的MS培养基上[1,6]。

1.2.3 培养方法 在0℃无菌条件下，培养48h后[4,6-8]，再在温度：20℃，光照强度：1000-1500Lx，每天光照时间：16h的条件下进行培养[1,2]。

1.2.4 计算方法 培养50天后取材，统计接种外植体的数量，诱导出的愈伤组织数量、不定芽的数量，并计算其愈伤组织诱导率和不定芽诱导率[9-10]，最终确定诱导暗紫贝母愈伤组织和不定芽的NAA和6-BA的最佳配比浓度。

2 实验结果与分析

2.1 培养实验结果

鳞茎外植体接种到培养基上20d之后开始逐渐生长，一部分鳞茎体积逐渐增大，其切口处外部有透明淡黄绿色的小颗粒状突起出现和（或）小的新芽生成，并且其诱导出的愈伤组织和不定芽体积逐渐增大，30d左右能够清晰地看到半透明状的质地疏松的愈伤组织和白色的不定芽，50d后愈伤组织和不定芽生长逐渐稳定（见图1）。培养50d后，将采集到的实验结果数据制成表1和表2。

表1 不同配比浓度NAA+6-BA诱导的鳞茎外植体愈伤组织数量

表2 不同配比浓度NAA+6-BA诱导的鳞茎外植体不定芽数量

2.2 实验结果分析

对实验相关结果进行计算。结果见表3、4。

表3 鳞茎外植体愈伤组织的诱导率（%）

从表3可知，不同浓度的激素组合会对鳞茎外植体愈伤组织的形成有一定影响，且其影响差异较为显著。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L配比浓度的培养基上鳞茎外植体愈伤组织诱导率为53.3%，明显高于其它浓度配比下的诱导率，比第二高诱导率高60%。

表4 鳞茎外植体不定芽的诱导率（%）

从表4可知，不同浓度的激素组合会对鳞茎新生芽的形成有一定的影响，且其影响差异较为明显。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.6 mg/L配比浓度的培养基上的鳞茎新芽生成率为73.3%，明显高于其它浓度配比下的生成率，比第二高生成率高22.2%。

3 讨论

文献报道贝母鳞茎再生途径主要有三条：1、外植体先经诱导形成愈伤组织，再由愈伤组织分化发育形成不定芽，最后由不定芽形成新的小鳞茎；2、愈伤组织表层和内层一些特化了的胚性细胞经多次分裂发育形成胚状体，进而再由胚状体形成小鳞茎；3、外植体表面直接生长出小芽或鳞茎，适用于暗紫贝母培育，且培育时间相对较短[3]。本实验即采用第三条培养途径，经实验证明培养时间相对较短，且直接培养可避免再次培养引起的霉变。由于本实验培养条件中光照时间为16h/d，所以诱导出的不定芽数目多于愈伤组织，且不定芽的色泽为白色，而愈伤组织呈蛋黄绿色，为质地疏松的半固态状。

本实验借鉴低温诱导对组培川贝母胚状体成苗的影响[8]和红豆杉愈伤组织培养[6]中防褐变措施，采用外植体接种后先经低温处理48h再进行培养的方法，此法可有效地抑制外植体内在多酚氧化酶（PPO）引起的褐变[11]。一般PPO最适温度为20-35℃，低温前处理可有效地抑制外植体在培育初期极易产生的褐变，同时低温也在一定程度上抑制了霉变的发生。添加了0.1g/L的cV也能在一定程度上抑制了褐变的发生[6]，但对于暗紫贝母的适用量仍需要在今后的实验中加以验证和讨论。PPO的最适pH值在6.0—7.4范围，大多在7.0-7.4范围[11]，而组织培养要求培养基的pH为5.8，因此应严格调试培养基的pH，也能从根本上抑制PPO的活性。

实验表明不同浓度NAA+6-BA配比对暗紫贝母鳞茎外植体新芽的生成和愈伤组织的形成有一定的影响。在本实验培养条件下，NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L浓度配比诱导形成的愈伤组织较多；NAA1.2mg/L +6-BA1.6mg/L浓度配比诱导生成的新芽较多；NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L浓度配比条件下生成的新芽和愈伤组织均较多。综合分析，NAA1.2mg/L为鳞茎诱导的适宜浓度，而愈伤组织和不定芽的诱导对6-BA浓度反应则不同，但都为适中浓度，过高或过低的浓度的NAA +6-BA组合都不适宜鳞茎的诱导。

通过对暗紫贝母愈伤组织和不定芽诱导的研究，可以进一步优化和建立川贝母培养体系，解决野生贝母资源紧缺的问题，为天然药物的开发奠定基础。

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