CEACAM1和VEGF在人脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

许刚柱， 刘凯歌， 张俊锋， 丁志斌， 张 鹏， 付 强， 盛旭东 (西安医学院附属医院神经外科， 西安 710077;通讯作者，E-mail:kaigeliu@gmail.com)

脑胶质瘤的发病率位居颅内原发性肿瘤首位，呈恶性侵袭性发展，其中广泛间质微血管形成是胶质瘤生长的生物学基础，但目前关于胶质瘤血管生成的机制尚不清楚。癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)基因家族成员之一，对体内外血管生成分析显示，CEACAM1有血管生成活性［1］，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促进肿瘤血管生成的最主要因子之一，CD105则是一种主要表达于新生血管内皮细胞上的糖蛋白，是目前最好的血管标志物［2］。本研究采用免疫组化法检测正常脑组织及胶质瘤中 CEACAM1、VEGF和 CD105标记的MVD表达情况，探讨CEACAM1、VEGF与胶质瘤血管生成的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2008－04～2010－04西安医学院附属医院及西京医院神经外科手术切除并经病理检查证实的人脑胶质瘤石蜡标本62例，其中男性35例，女性27例，年龄17－73岁(平均43.5岁)。所有标本常规切片，HE染色后根据2000年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准分类，其中Ⅰ级14例，Ⅱ级17例，Ⅲ级18例，Ⅳ级13例。另取因颅脑损伤行内减压术患者15例的正常脑组织作为对照(与家属沟通后签字同意用作科学研究，并经医院伦理委员会审批同意)。

1.2 主要试剂及方法 兔抗人CEACAM1单克隆抗体购自美国Epitomics公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体购自美国Labvision公司，鼠抗人CD105单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术公司，免疫组化SP试剂盒购自北京中杉生物技术公司。采用SP法检测，按常规步骤进行，兔抗人CEACAM1单克隆抗体滴度为1∶70，鼠抗人 VEGF单克隆抗体滴度为1∶50，鼠抗人 CD105 单克隆抗体滴度为 1∶50，以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。

1.3 结果判定与计数 ①CEACAM1阳性判定方法:细胞膜和(或)细胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。采用阳性标记指数(label index，LI)判定染色结果，即在每张切片阳性细胞最多的区域计数500－1 000个细胞，按LI(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%计算出每例的LI，每组数据用±s表示。

②VEGF阳性判定方法:VEGF阳性染色为棕黄色颗粒样着色，定位于肿瘤细胞的细胞质内。观察计数方法同CEACAM1。

③CD105阳性判定及MVD计数:CD105阳性染色为血管内皮细胞膜和/或细胞质呈棕黄色或棕褐色着色。MVD计数参照Weidner等［3］的方法:先在低倍视野(×10倍)下选取肿瘤微血管密度最高区(热区)，再于高倍视野(×100倍)下计数，凡呈现棕黄(褐)色的单个血管内皮细胞或细胞簇，只要其与邻近肿瘤细胞或结缔组织成分有明显区别，即可记数为1个微血管数。每张切片记录5个高倍视野下微血管数目，取其均值作为该标本的MVD(±s)，用MVD值表示CD105表达数量。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。全组数据采用±s表示，两组间比较用t检验，多组比较采用方差分析，总体有差异后进一步用LSD进行两两比较。相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤与正常脑组织CEACAM1的表达 本研究发现，CEACAM1在正常脑组织中无表达(图1)，在各级胶质瘤组织中均有CEACAM1阳性表达(图2)。各级胶质瘤组织与正常脑组织中CEACAM1的表达相比较，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，且胶质瘤各级别之间比较，差异亦具有统计学意义(P＜0.01，见表1)，随病理分级升高逐渐增高(r=0.857，P ＜0.01)。

图1 正常脑组织CEACAM1阴性表达 (SP，×400)Fig 1 CEACAM1 protein negative expression in normal brain tissues(SP，×400)

图2 Ⅲ级胶质瘤CEACAM1阳性表达 (SP，×400)Fig 2 CEACAM1 protein positive expression in gradeⅢglioma(SP，×400)

2.2 胶质瘤与正常脑组织VEGF表达 正常脑组织中未见VEGF表达。VEGF阳性染色定位于胶质瘤细胞胞质(图3)。从表1可见，不同病理分级的肿瘤细胞VEGF的阳性细胞标记指数不同，与正常脑组织相比较，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，且随病理分级提高逐渐增高(r=0.968，P ＜0.01)。

2.3 CD105标记的MVD计数 CD105蛋白阳性定位于肿瘤微血管内皮细胞细胞膜和/或细胞质，呈棕黄(褐)色细颗粒状。正常脑组织未见CD105阳性表达，各级胶质瘤标本均有CD105阳性表达(图4)。各级别胶质瘤与正常脑组织中CD105-MVD的表达差异均具有统计学意义(P＜0.01)，且随病理分级提高逐渐增高(r=0.780，P ＜0.01)。

表1 CEACAM1、VEGF表达及MVD与临床病理参数的关系(±s)Tab 1Relationship of CEACAM1，VEGF expression and MVD with clinicopathological characteristics(±s)

表1 CEACAM1、VEGF表达及MVD与临床病理参数的关系(±s)Tab 1Relationship of CEACAM1，VEGF expression and MVD with clinicopathological characteristics(±s)

单因素方差分析，aF=68.235，P ＜0.01;bF=786.332，P ＜0.01;cF=30.418，P ＜0.01;然后采用 LSD 两两比较均 P ＜0.01

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图3 Ⅳ级胶质瘤VEGF阳性表达 (SP，×400)Fig 3 VEGF protein positive expression in gradeⅣglioma(SP，×400)

图4 Ⅲ级胶质瘤CD105阳性表达 (SP，×100)Fig 4 CD105 protein positive expression in gradeⅢglioma(SP，×100)

2.4 CEACAM1、VEGF表达和 CD105-MVD 与胶质瘤临床病理参数的关系 CEACAM1、VEGF表达和CD105-MVD与患者的性别、年龄及肿瘤大小无明显相关(P ＞0.05，见表1)。

2.5 CEACAM1、VEGF表达与MVD的相关性 相关分析显示，CEACAM1表达与MVD呈正相关(r=0.889，P ＜0.01)，VEGF表达与 MVD 亦呈正相关(r=0.803，P ＜0.01)，且 CEACAM1 与 VEGF 表达亦呈正相关(r=0.846，P ＜0.01)。

3 讨论

CEACAM1作为一种细胞表面跨膜糖蛋白，可以调节同源性、异源性黏附，并且在一些正常人体组织中包括结肠、乳腺、前列腺和子宫都有表达，除此之外CEACAM1在这些组织的恶性病变中都减少表达或不表达，CEACAM1表达的丢失和恶性肿瘤的分级相关，故而CEACAM1被推测具有抑制肿瘤细胞生长的效应［4］。但在肺癌和胰腺癌的研究中则提出了与CEACAM1具有肿瘤抑制效应相反的结果［5，6］:CEACAM1 阳性病例恶性程度上升，说明CEACAM1的表达能促进肿瘤的生长。

本文研究结果显示，CEACAM1在胶质瘤组织中的表达较正常脑组织中明显升高(P＜0.01)，说明胶质瘤组织也存在CEACAM1异常高表达，而且发现CEACAM1在胶质瘤组织中的表达并不只是在细胞膜上，在细胞质中亦有表达。Zhou等［7］通过在胃癌中的研究认为，CEACAM1分布的改变(从细胞膜到细胞质)在肿瘤血管发生中是一个重要的事件，并且CEACAM1的高表达促进了癌细胞向淋巴结的转移。在口腔癌中的研究［8］表明，分化良好的鳞状细胞癌中CEACAM1呈现为细胞膜表达，低分化和中分化分化性腺癌则是在细胞质中表达;细胞膜的CEACAM1表达抑制血管发生和淋巴管发生，但是胞质的CEACAM1表达则促进血管发生，甚至通过调节血管内皮细胞向淋巴管内皮细胞变形而促进淋巴管形成。胶质瘤中CEACAM1表达部位的改变与血管生成的关系尚需要进一步研究。

我们发现CEACAM1在人脑胶质瘤中的表达与患者的年龄、性别以及肿瘤大小无明显相关性(P＞0.05)，而与肿瘤的病理分级密切相关(P ＜0.01)。肿瘤的恶性程度越高，CEACAM1的阳性表达率越高，故而说明CEACAM1表达的上调可能是肿瘤发生发展中的重要生物事件，提示CEACAM1在人脑胶质瘤发生发展中可能扮演着癌基因的角色，这与Sienel等［9］的研究结论类似:提示 CEACAM1表达升高是一不利的预后指标，它可能与促进肿瘤细胞生长有关。

VEGF又称血管渗透性因子(vascular peameability factor，VPF)，是肿瘤形成过程中最重要的刺激因子，在血管发生和形成过程中都具有重要的作用［10］。它具有双重功能:一方面通过其受体直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导产生蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子来促进血管形成;另一方面，提高血管通透性，促进血浆蛋白、纤维蛋白原外渗导致肿瘤间质水肿，引起细胞外基层改变，从而为肿瘤浸润及转移提供适合的基础。在本实验中胶质瘤中VEGF的表达明显高于正常脑组织(P＜0.05)，不同病理分级的肿瘤细胞VEGF的阳性细胞标记指数不同，高度恶性组明显高于低度恶性组，经检验差异有统计学意义(P＜0.05)，说明VEGF与胶质瘤的恶性度有关，提示VEGF蛋白的高表达在胶质瘤发生发展过程中起着重要的作用，可作为反映胶质瘤恶性程度的指标。

微血管密度(MVD)是检测肿瘤血管形成活性的重要指标。CD105仅在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞(即新生的血管内皮细胞)上强烈表达，而在正常组织的血管上无或仅微弱表达［11］，是一种新的内皮细胞增殖标记物。本研究应用CD105标记胶质瘤微血管并对其进行定量检测，结果显示:CD105在胶质瘤内呈特异性高表达，其标记的MVD显著高于正常脑组织，提示CD105在胶质瘤血管形成中起重要作用，可作为胶质瘤新生血管生成的理想标志物。本研究还发现，CEACAM1、VEGF均与CD105标记的 MVD呈正相关，提示 CEACAM1、VEGF可能均有促进肿瘤血管生成的作用;且CEACAM1和VEGF具有明显的相关性，提示两种蛋白可能在新生血管形成中具有协同作用。

肿瘤中CEACAM1表达升高的机制目前尚不清楚，吕满义等［12］研究认为可能与CEACAM1促进这些肿瘤组织血管生成有关，CEACAM1可能是一种促进肿瘤生长、转移的重要指标。Ergun等［1］对体内外血管生成分析显示，CEACAM1有血管生成活性，利用鸡绒膜尿囊膜培养试验证实，不管是从人粒细胞培养的内皮细胞分离的CEACAM1还是重组的CEACAM1都有血管形成特性，而且CEACAM1的单克隆抗体可以在体外阻断VEGF介导的微血管内皮细胞形成的作用，VEGF使培养的人内皮细胞的CEACAM1在mRNA及蛋白水平上都是增加的。一方面CEACAM1表现出与VEGF相似的成血管特性，另一方面功能性抑制CEACAM1可以完全抑制VEGF诱导的形态学事件的发生，表明VEGF的基本成血管特性可能是CEACAM1调节的。

总之，CEACAM1、VEGF及CD105-MVD均可作为反映胶质瘤恶性程度的指标;CEACAM1在胶质瘤中扮演着癌基因的角色，其表达增加可能引起胶质瘤的发生、发展;CEACAM1可能作为一种促血管生长因子而刺激肿瘤血管的生成，随着对CEACAM1研究的深入可能会对胶质瘤的防治产生有益的影响。

［1］ Ergun S，Kilik N，Ziegeler G，et al.CEA-related cell adhesion molecule 1:a potent angiogenic factor and a major effector of vascular endothelial growth factor［J］.Mol Cell，2000，5(2):311 －320.

［2］ 王弱，刘爱东，庞久玲，等.CD105在结直肠腺癌组织中的表达及意义［J］.山东医药，2007，47(20):27.

［3］ Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36:169 － 180.

［4］ Seheffrahn I，Singer BB，Sigmundsson K，et al.Control of densitydependent，cell state-specific signal transduction by the cell adhesion molecule CEACAM1，and its influence on cell cycle regulation［J］.Exp Cell Res，2005，307(2):427 －435.

［5］ 袁榴娣，丁洁，李震.肺癌中肿瘤抑制基因CEACAM1的选择性拼接与PTB的过表达有关［J］.肿瘤防治研究，2006，33(5):320－323.

［6］ Simeone DM，Ji B，Banerjee M，et al.CEACAM1，a novel serum biomarker for pancreatic cancer［J］.Pancreas，2007，34(4):436－443.

［7］ Zhou CJ，Liu B，Zhu KX，et al.The different expression of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1(CEACAM1)and possible roles in gastric carcinomas［J］.Pathol Res Practice，2009，205(7):483 －489.

［8］ Zhou CJ，Qu X，Yang YM，et al.CEACAM1 distribution and its effects on angiogenesis and lymph angiogenesis in oral carcinoma［J］.Oral Oncol，2009，45(10):883 － 886.

［9］ Sienel W，Dango S，Woelfle U，et al.Elevated expression of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 promotes progression of non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2003，9(6):2260 －2266.

［10］ Carmeliet P.VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer［J］.Oncology，2005，69(3):4 －10.

［11］ 王艳芬，丁永玲，李家驭，等.Ang-2、CD105和CD34在脑胶质瘤中的表达及生物学意义［J］.现代肿瘤医学，2008，16(1):23－26.

［12］ 吕满义，纪新强，高占军.CEACAM1和VEGF在官颈鳞癌组织中的表达及临床意义［J］.肿瘤基础与临床，2008，21(1):20－22.