东乡族内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与替米沙坦降压疗效及糖脂代谢相关性研究

张永正，王玉，闵海，马丽雅

原发性高血压(essential hypertension，EH)是遗传因素与环境共同作用的多基因遗传病，具有高度遗传异质性、迟显性和易感基因外显不全性，这为确定EH相关基因的研究带来极大困难。EH候选基的研究一直受到科研人员的重视，其中种族与EH的关系很早就被关注。研究表明内皮一氧化氮合酶(eNOS)是左旋精氨酸一氧化氮途径的关键酶，eNOS催化合成的一氧化氮具有扩血管、调节血流、阻止肾素-血管紧张素的产生、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集、黏附和白细胞趋化作用［1］，eNOS基因第7个外显子的突变即894位碱基G变成T(G894T)导致GLU298ASP的错译，此突变影响eNOS酶表达，使NO生成减少，导致血管紧张素增加，内皮受损，血管收缩障碍导致血压升高。有效控制血压是降低心血管疾病患病率和病死率的关键，临床观察发现不同个体对同一降压药物的反应性存在差异，这种差异不能完全用年龄、性别、疾病、用药等来解释。这提示抗高血压药物对原发性高血压患者降压疗效的个体差异可能与不同个体的遗传异质性相关。进一步研究显示G894T多态性中T等位基因可能是治疗反应的预测因素［2］。本研究对甘肃临夏州东乡族270例原发性高血压患者应用替米沙坦进行治疗，旨在探讨其降压疗效与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多态性的相关性，及对高血压并糖尿病患者糖脂代谢的影响。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取2007年6月至2009年3月在甘肃省临夏州人民医院心内科住院及门诊患者，均为长期生活在当地无三代以内血缘关系的东乡族高血压患者，共270例，其中男性189例，女性81例，年龄(55.82±8.31)岁，以2005年《中国高血压防治指南》为高血压患者纳入标准［3］，排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病及肾功能衰竭者。选出符合条件的40例高血压合并糖尿病患者。糖尿病入选标准符合糖尿病诊断标准:按空腹血糖＞7.0 mmol/L，餐后血糖 ＞11.1 mmol/L，排除严重肝肾功能不全，血肌酐 ＞180 μmol/L，继发性高血压，糖尿病肾病及应用胰岛素治疗患者。该40例患者采用饮食，运动，口服药物(二甲双胍、拜糖平)等综合手段血糖控制在合理范围内。对受试对象均签署知情同意书，经2周安慰剂洗脱，均进入试验程序。

1.2 方法

1.2.1 实验前测定临床指标 调查时测量身高、体重、体重指数(BMI)、血压及空腹静脉血，检测空腹血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血尿酸。

1.2.2 给药过程 入选270例患者每日早8时口服替米沙坦40 mg，治疗4周。4周后测量血压，其中40例糖尿病患者继续治疗至第10周后检测空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C、血尿酸。

1.2.3 DNA的提取 采用血液基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工血液基因组DNA小量抽提试剂盒)抽提基因组DNA。

1.2.4 PCR扩增 PCR引物:上游引物:LotNO.AW60599.5＇-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3＇;下游引 物:Lot NO.AW60600.5 ＇-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3＇(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。PCR反应体系(50 μL反应体系):(广东东盛生物科技有限公司)，经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果并照相(图1)。

图1 eNOS基因G894T特异性PCR产物电泳图

1.2.5 基因型的检测 酶切反应体系15 μL，限制性内切酶 BanⅡ0.5 μL(Promega Corporation Lot238827)，10× REBuffer 1.5 μL，BSA 0.15 μL，PCR 产物 10 μL，灭菌去离子双蒸水定容至15 μL。混匀后离心30 s，置37℃电热水浴箱水浴8 h。产物用3%琼脂糖凝胶电泳，稳压电泳，100 V电压，电泳45 min，EB染色，紫外灯下观察结果并照相。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件包，进行统计学分析。对研究对象的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，基因型、等位基因频率和组间计数资料间比较采用χ2检验，计量资料结果以均数±标准差(±s)表示，两组均数间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 eNOS基因G894T多态性分析(图2) 受检者DNA经PCR扩增产物为248 bp片段。G等位基因存在酶切位点，而T等位基因没有酶切位点。若在此片段中不存在894G→T位点突变，即:基因型为GG纯合子，出现限制性内切酶BanⅡ的酶切位点，酶切后得到大小为163 bp和85 bp两个长度片段;含有894G→T点突变的纯合子，即TT基因型，不能被限制性内切酶BanⅡ切开，仍为一大小248 bp的长度片段;含有894 G→T点突变的杂合子基因型为GT型，酶切后既出现248 bp，又出现163 bp和85 bp长度片段。

2.2 高血压患者基因型分布及频率 基因分型表明，高血压患者eNOS基因G894T存在GG纯合、TT纯合和GT杂合3种基因型。完成该实验的270例患者中，GG基因型201例，GT基因型为61例，TT基因型为 8例，基因型频率分别为 74.44%、22.59%、2.97%，G 等位基因频率为 85.71%，T 等位基因频率为14.29%。把等位基因频带入H-W公式 p+q=1，p2+2pq+q2=1，符合 Hardy-Weinberg平衡检验。即:所选样本具有群体代表性。

图2 eNOS基因G894T特异性PCR产物酶切后电泳图

2.3 各生化及临床指标的基线水平 随机入选270例高血压患者。受试者各生化及临床指标基线水平(表1)，根据GG纯合、TT纯合和GT杂合3种基因型，分为GG组及GT+TT组，经检验两组间年龄性别相匹配，差异无统计学意义(P均＞0.05);两组间血糖、TG、TC相比，差异无统计学意义(P均＞0.05);两组间收缩压(SBP)、舒张压(DBP)基线水平比较，差异无统计学意义(P均＞0.05);两组间体重指数(BMI)比较，GT+TT组高于GG组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表1 GG组和GT+TT组临床基本特征

2.4 eNOS基因G894T不同基因型组应用替米沙坦前后血压变化 两组患者治疗4周后的SBP、DBP均比治疗前明显下降(P＜0.05)。GG基因型组SBP下降幅度(13.6±6.6)mm Hg大于 GT+TT基因型组 SBP下降幅度(9.2±5.7)mm Hg，差异有统计学意义(P＜0.05)。GG基因型组DBP下降幅度(11.4±4.3)mm Hg＞GT+TT 基因型组 DBP 下降幅度(8.5 ±4.4)mm Hg，差异有统计学意义(P ＜0.05)(表2、表3)。

表2 GG组和GT+TT组治疗前后血压对比(±s)

表2 GG组和GT+TT组治疗前后血压对比(±s)

注:与治疗前同类血压相比，aP＜0.05

项目 GG组(n=201)GT+TT组(n=69)164.2 ±13.9 165.5 ±14.2治疗前舒张压(mm Hg) 96.7 ±11.2 97.2 ±10.5治疗后收缩压(mm Hg) 150.6 ±10.4a 156.2 ±12.3a治疗后舒张压(mm Hg) 85.2 ±9.5a 88.7 ±10.1治疗前收缩压(mm Hg)a

表3 GG组和GT+TT组治疗前后血压降幅对比

2.5 替米沙坦治疗前后血糖、血脂、血尿酸的变化选取40例高血压合并糖尿病患者，其中GG基因型29例，GT基因型10例，TT基因型1例，经替米沙坦治疗后 TG，TC，空腹血糖，LDL-C，HDL-C，血尿酸，均显著降低(P＜0.01)(表4)，因病例数少未作基因组间比较。

表4 替米沙坦治疗前后血糖、血脂、血尿酸变化表(±s)

表4 替米沙坦治疗前后血糖、血脂、血尿酸变化表(±s)

注:TG:甘油三酯;TC:总胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;与治疗前相比，aP＜0.01

项目 治疗前 治疗后TG(mmol/L) 2.21 ±1.02 1.71 ±0.63a TC(mmol/L) 5.38 ±1.31 4.84 ±0.87a空腹血糖(mmol/L) 6.77 ±1.07 6.36 ±0.78a LDL-C(mmol/L) 2.93 ±0.92 2.53 ±0.65a HDL-C(mmol/L) 1.20 ±0.25 1.38 ±0.23a血尿酸(umol/L) 446.56 ±110.56 378.52 ±78.95a

3 讨论

替米沙坦是一个非肽类血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂，通过在AT1受体水平特异阻断血管紧张素系统而同时阻断了由经典途径(肾素-血管紧张素系统)及非经典途径产生的AngⅡ的作用，降压效果更好，对其他激素无影响，且清除半衰期为24 h决定了降压疗效较持久［4］。

本研究选取甘肃省东乡族人群作为研究对象，该民族的祖先主要是13世纪以后从中亚和西亚等地迁徙而来的撒尔塔人，有自己的语言和独特的生活习惯，全民信奉伊斯兰教。东乡族人群生活相对封闭，主要聚居在甘肃省临夏回族自治州东乡族自治县。影响血压的环境因素:如生存环境、生活方式、饮食习惯和精神压力等均较为一致，所选270例高血压患者均为首诊患者，减少了影响统计结果的混杂因素。

研究表明人类eNOS基因位于染色体7q35-36，全长21 kb，有26个外显子，25个内含子，现已发现其基因存在近10个多态性位点，其中894位点碱基G被T所取代，导致编码产物第298号氨基酸由GLU变为ASP，进而影响NO合成，参与高血压的发生和发展［2］。目前有研究证实eNOS基因该位点多态性与高血压发病，以及治疗耐药有相关性［5］，因此被认为是一种功能突变。进一步的研究显示，高血压患者eNOS基因G894T多态性可能是患者对降压治疗敏感性不同因之一，在难治性高血压病例中，T等位基因频率较高［2］。Juchymova 等［2］研究了波西米亚地区的高加索人群中85例正常对照者和119例高血压患者，发现eNOS的GLU298ASP多态性可能是患者对传统降压治疗的抵抗因素之一。

本研究显示，270例东乡族原发性高血压患者中两组间血糖、TG、TC等生化指标相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。GT+TT组 SBP、DBP高于GG组，BMI明显高于GG组，而且P＜0.05，差异有统计学意义。这提示eNOS基因G894T多态性T等位基因变异与BMI升高之间的交互作用对高血压的发病可能有一定作用。Benjafield等［6］研究显示，G894T变异者BMI可显著升高且存在剂量-反应关系，与本研究结论相一致。Lapu等［7］在中国重庆对eNOS G894T多态性的研究结果是，eNOS不直接导致高血压，但可能通过与其他危险因子起到升高血压的作用。王丛等［8］对内蒙古地区蒙古族的研究认为，G894T多态性是高血压病的独立危险因素，提示EH易感基因的作用可能具有地域性，而新疆哈萨克族eNOS基因G894T多态性与EH不相关［9］。本研究在用药4周后SBP、DBP均比治疗前有明显下降(P＜0.05)，这提示患者对替米沙坦的降压作用反应良好;而且GG基因型组SBP和DBP的下降幅度均大于GT+TT基因型组的下降幅度，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示G等位基因携带者对替米沙坦的降压疗效优于T等位基因携带者。这与Jachymova和国内狄群等［2，10］的研究相一致。但与王琳［11］和 Khawaja等［12］的研究有不同之处。出现上述差异可能与种族，遗传有关［13］，遗传环境和生活习惯相互作用可能是结论不一致的原因之一。因此eNOS基因多态性对不同患者降压药物的选择具有指导意义，本研究发现替米沙坦对GG基因型的降压疗效明显强于GT+TT基因型，说明替米沙坦疗效与T等位基因有关。

本研究亚组分析也看到了替米沙坦对代谢综合征患者糖脂代谢的影响，在应用替米沙坦治疗10周后患者血糖、TG、TC、LDL-C、血尿酸均较治疗前明显下降，而HDL-C升高(P＜0.01)。替米沙坦是新一代ARBs，降压安全有效，并且替米沙坦与胰岛素增敏剂吡格列酮的化学结构相似，有选择性激动PPAR-γ(过氧化物酶增殖体活性受体γ)的作用，因而推测其有减轻胰岛素抵抗改善糖脂代谢的作用，基础研究证实替米沙坦对胰岛素抵抗大鼠可改善胰岛素敏感性［14-15］。替米沙坦除了能够增强胰岛素敏感性外，还可以改善动脉粥样硬化的多种致病决定因子，如增加脂联素水平，减少炎症发生，降低氧化应激等，体外研究显示替米沙坦可以减少胰岛素β细胞内脂肪酸诱导的氧化应激和NADPH氧化还原酶活性，从而证实替米沙坦有保护胰岛β细胞的作用［16］。PPRA-γ激活后可降低血浆游离脂肪酸水平，促进葡萄糖进入骨骼肌，抑制脂肪细胞表达和分泌肿瘤坏死因子，降低脂肪细胞分泌脂联素，从而改善胰岛素抵抗，降低血糖和改善血脂紊乱，起到胰岛素增敏作用，并具有抗炎抗氧化及保护内皮功能作用，本研究显示在良好的降压效果下，替米沙坦可以改善高血压并糖尿病患者血糖及血脂水平。本研究中替米沙坦降低血糖、血脂的结果与陈远刚［17］和Negro等［18］在糖尿病合并高血压人群应用替米沙坦短期治疗(10～12周)的结果是一致的。

本研究从分子生物学角度研究了eNOS基因G894T多态性与原发性高血压利用药物干预间的关系及对糖脂代谢的影响。显示Glu298对替米沙坦治疗反应优于Asp298，G等位基因携带者可能是临床上选择AngⅡ受体拮抗剂适应者。这对有条件进行基因甄别的高血压患者有一定临床指导意义。也显示了替米沙坦在糖脂代谢方面其独特的作用。但是，本研究的样本量较小，候选基因单一，可能影响结论的准确性;需扩大样本量并增加多个候选基因，进行联合研究分析后加以证实。

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