基质金属蛋白酶 MM P-9与其抑制剂 TIMP-1在子宫内膜腺癌中的表达及其临床意义

卢北燕,王艳平

(佳木斯大学附属第一医院妇产科,黑龙江 佳木斯 154003)

子宫内膜癌是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一,约占女性总癌瘤的 7%,占女性生殖道恶性肿瘤的 20%～30%[1],近年来发病率有升高并且发病年龄有年轻化的趋势,更是西方国家女性最常见的女性生殖道恶性肿瘤,严重威胁人类健康[2]。本试验是通过子宫内膜癌组织的免疫组化的研究 ,了解子宫内膜癌患者组织中 MM P-9、TIM P-1的表达,并采用多参数统计学分析该检测结果,探讨 MM P-9、TIMP-1在肿瘤转移、侵袭中的作用,为子宫内膜癌的临床监测及预后判断提供新的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 实验对象

收集佳木斯大学附属第一医院妇产科 2006—01～2009— 12住院手术并经病理确诊的 60例子宫内膜样腺癌患者所存档的组织蜡块,所有患者术前均未作过任何化疗、放疗或性激素类药物等治疗,其中所有标本的临床和病理资料完整,病理诊断均经其中所有标本的临床和病理资料完整,病理诊断均经病理科专家复核。患者年龄 31～ 73岁,平均 52岁,≤50岁者 32例,＞ 50岁者 28例;35例已绝经,25例未绝经;子宫内膜样腺癌按照 2000年国际妇产科联盟(FIGO)手术 -病理分期标准:Ⅰ 期 33例,Ⅱ期 23例,Ⅲ期 4例;组织学分级:高分化(Gl)17例,中分化(G2)20例,低分化(G3)23例;子宫肌壁侵润深度:无肌层浸润 6例 ,侵及子宫壁浅肌层 (≤1/2肌层 )者 31例 ,侵及深肌层 (＞ 1/2肌层)者 23例;淋巴结转移(行淋巴结清扫和取样者):已发生淋巴结转移者6例,无淋巴结转移者 28例。另取同期正常子宫内膜组织(取自子宫肌瘤行手术切除术的患者)18例、非典型增生性子宫内膜组织存档蜡块 23例作为对照。所有标本均经 10%福尔马林液固定,石蜡包埋,5μm厚连续组织切片。

1.2 方法及步骤

①脱蜡和水化:将组织切片经 58℃烤片 1h,按以下次序脱蜡:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各浸 10min;无水乙醇 10min;90%乙醇 10min;80%乙醇 10min;双蒸水冲洗 3次;PBS浸洗 3min共 3次。②3%过氧化氢处理:浸于新鲜培植的 3%过氧化氢溶液中避光放置 10min,以灭活内源性过氧化物酶。双蒸水冲洗 3次,PBS浸洗 3min,共 3次。③抗原修复:孵育盒中放人切片,并加入 50mL 0.01mol/L枸橼酸缓冲液 (pH=6.0),于微波炉加热中火 MV(95℃)5min共两次,两次之间加入10mL枸橼酸缓冲液,第二次加热以后从微波炉中取出孵育盒,自然冷却至室温(18～ 25℃),PBS浸洗 3min共 3次。 ④封闭:滴加 10%正常山羊血清封闭 30min,消除非特异性反应,甩去多余液体,不洗。⑤滴加一抗:分别滴加一滴 Bcl-xl鼠抗人单克隆抗体和兔抗人 Beclin1多克隆抗体,湿盒中孵育,4℃过夜 ,PBS浸洗 3min共 3次,小心擦拭多余液体。⑥滴加二抗:分别滴加一滴生物生化山羊抗兔 IgG,湿盒中孵育,37℃温箱放置 50min,PBS浸洗 3min共 3次,小心擦拭多余液体。⑦滴加三抗:分别滴加一滴高敏过氧化物酶复合物,湿盒中孵育,37℃温箱放置 50min,PBS浸洗 3min共三次,小心擦拭多余液体。⑧DAB-H2O2显色:每张切片上滴加 1～ 2(30～ 40μL)滴显色液于标本上,置湿盒内室温显色,一般显色 5～ 15min。若无背景出现可继续显色 ,充分水洗。⑨复染:Harris苏木素复染,充分水洗。L脱水、透明、封片:50%、75%、85%、95%和 100%系列乙醇脱水;二甲苯透明;重型光学树脂封片。光学显微镜下观察结果。对照实验:以 PBS替代一抗作为阴性对照,以试剂盒内已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 结果判定

光学显微镜下均以胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色细胞,MM P-9与 TIM P-1的阳性颗粒均分布于细胞浆。判断标准:参考师建国[1,2]的评估标准:每例切片选取内膜细胞密集的区域,连续观察高倍视野,对肿瘤细胞进行细胞计数,每个视野计数 50个细胞,共 1000个细胞,通过计算着色细胞所占比例及评定着色强度而分级。①无着色细胞、背景同阴性对照或者阳性细胞比例不超过 5%者为阴性(-);②阳性细胞呈淡棕黄色和/或阳性细胞率 ＜50%者为弱阳性(+);③阳性细胞呈深棕黄色和 /或阳性细胞率≥50%者为强阳性(++)。阳性细胞的判断标准:免疫组化的阳性表达均为各自染色条件下结构完整、定位明确、染色对比清晰的棕黄色细胞。为便于统计,将 (+)和(++)统归为阳性。

1.4 统计分析

采用秩和检验,确切概率法及 Spearman等级相关分析,数据采用 SPSS 16.0软件包分析。显著性检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MM P-9蛋白在不同子宫内膜组织中的表达

MM P-9蛋白的表达主要定位于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆,呈棕黄色颗粒,弥漫性或局灶性分布。见表 1。

表 1 MM P-9在不同子宫内膜组织中的表达

2.2 M MP-9蛋白与子宫内膜样腺癌临床病理特征的关系

见表 2。

表 2 TIM P-1蛋白的表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

本研究采用免疫组化的方法,通过检测正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜腺癌组织中 MM P-9蛋白的表达得出初步结论:MMP-9蛋白在正常内膜组织、不典型增生内膜组织及子宫内膜样腺癌中的阳性表达率分别是16.67%、56.52%和 78.33%,三者之间的阳性表达率有统计学差异。在子宫内膜由良性到恶性转变的不同阶段,M MP-9阳性表达呈现逐渐增强的趋势,说明其与子宫内膜组织癌变关系密切,与子宫内膜癌的发展演进有关,此结论与大多数研究的结论基本一致。结合患者的临床病理特征进行了分析,发现 33例Ⅰ期子宫内膜癌中,MM P-9蛋白阳性表达21例,23例Ⅱ期子宫内膜癌中,MM P-9蛋白阳性表达 22例,4例Ⅲ A期患者 MMP-9的阳性表达为 4例,三者 M MP-9蛋白阳性表达率比较有统计学差异,晚期子宫内膜癌中MM P-9蛋白的表达明显高于早期。MM P-9通过降解细胞外基质,为肿瘤细胞向周围组织浸润提供了有利条件,同时还为肿瘤新生血管的生长提供了空间。Iurlaro等[3]用免疫组化、原杂交位技术检测了 64例子宫内膜癌及 15例正常对照组的 MM P-9的表达情况,子宫内膜癌组织中 MM P-9的表达显著高于正常对照组 (P＜0.01),并随病理组织分级(Gl,G2,G3)和肌层浸润程度的增加而表达增加,本实验结果与此相一致。近年来国内外许多学者研究证明,MM Ps与 TIM Ps之间的相互作用在月经发生、子宫内膜的重塑、胚胎着床及胚胎种植等生理过程中起着关键的作用[4]。

本研究采用免疫组化的方法,通过检测正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜腺癌组织中 TIM P-1蛋白的表达得出初步结论:TIM P-1蛋白在正常内膜组织、不典型增生内膜组织及子宫内膜样腺癌中的阳性表达率分别是72.22%、65.22%和 41.67%,三者之间的阳性表达率有统计学差异。在子宫内膜由良性到恶性转变的不同阶段,TIMP-1阳性表达呈现逐渐增强的趋势,说明其与子宫内膜组织癌变关系密切,与子宫内膜癌的发展演进有关,此结论与大多数研究的结论基本一致[3]。

本研究还结合患者的临床病理特征进行了分析,发现:(1)33例Ⅰ期子宫内膜癌中,TIM P-1蛋白阳性表达 18例,23例Ⅱ期子宫内膜癌中,TIM P-1蛋白阳性表达 5例,4例Ⅲ A期患者 TIM P-1的阳性表达为 0例,三者 TIMP-1蛋白阳性表达率比较有统计学差异,早期子宫内膜癌中 TIMP-1蛋白的表达明显高于晚期。 TIM P-1可与 MM P-9前体及有活性的 MM P-9形成高度亲和的、非共价键结合的复合物。重要的是 TIM P-1与活化的或非活化的 92kDa的MM P-9的结合抑制了 MM P-9水解蛋白的活性 ,TIMP-1还被认为作为一种转录抑制剂抑制 M MPs基因的转录[91];(2)G1组中的 TIM P-1蛋白阳性表达率高于 G3,TIM P-1蛋白的表达随着病理分级的增加呈减少趋势,病理分级是反映肿瘤生物行为的最本质特征之一,分化越差,其生物学行为越恶劣,预后越差;(3)无肌层浸润的阳性表达明显高于有肌层浸润的患者;浸润深度≤1/2组及浸润深度＞1/2组的表达有显著性差异并且随肌层浸润程度的加深其表达呈减少趋势;(4)TIMP-1蛋白在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组的阳性表达率差别不大,无统计学意义,与多数研究不一致,可能与淋巴结转移的病例太少有关。在 60例子宫内膜样腺癌患者标本中,MM P-9的阳性表达为 47例,而 TIMP-1的阳性表达为 23例。两者表达呈负相关性(r=-0.603,P= 0.0004)。肿瘤细胞及间质细胞合成的MM P-9,正好可以降解基底膜主要成分Ⅳ型胶原,从而促进肿瘤的侵袭和转移[6]。 TIM P-1是 MM P-9特异性抑制剂,TIM P-1可与 MM P-9前体及有活性的 MM P-9形成高度亲和的、非共价键结合的复合物。可认为两者在肿瘤的发生、浸润和转移过程中相互抑制、共同作用。由于手术-病理分期、组织分级、肌层浸润和淋巴结转移可反映疾病恶性程度 ,与患者预后相关,对 MM P-9、TIM P-1的测定可帮助临床医师判断预后,指导临床治疗,因此于 MM P-9阳性而 TIM P-1阴性表达的患者制订合理的综合治疗方案。

[1]乐杰.妇产科学 [M].第 7版,北京:人民卫生出版社,2008,272

[2]曹泽毅.中华妇产科学[M].第 2版,北京:人民卫生出版社,2005

[3]Iurlaro M,Loverro G,Vacca A,et al.Angiogenesis extent and expression of matrix metalloproteinase- 2 and 9 correlate with upgrading and myometrial invasion in endometrial carcinona[J].Eur J Clin Invest,1999,29:793-801

[4]Visse R,Hideaki N.Matrix metalloproteinases and issue inhibitors of metallo-proteinases structure,function,and biochemistry[J].Circ Res,2003,92:827

[5]Sato H,and Seiki.Regulation machanism of93kDa type IV collagenase gene exprssion which is associated with invasiveness of tumor cells[J].Oncogene,1993,(8)2:395

[6]王守彪.基质金属蛋白酶与组织金属蛋白酶抑制因子在肾细胞癌中的研究进展 [J].首都医药,2006,(12):36-38