红景天苷与脑源性神经营养因子联合对 NSCs定向分化及对癫痫影响

和 梅,张 瑶,关雪莲,侯立醇,张淑萍,张军武,刘力学,刘美玲

(1.佳木斯大学附属第一医院神经内科,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学研究生学院,黑龙江 佳木斯 154007)

癫痫是神经系统中仅次于脑血管病的第二大疾病,我国约 600多万患者,其中 25%为难治性癫痫 ,目前主要有药物和外科治疗两种手段,其效果均不理想。现今神经干细胞移植治疗癫痫已是研究热点。本实验通过观察红景天苷、脑源性神经营养因子(BDNF)联合对体外海马神经干细胞(NSCs)向 r-氨基丁酸(GABA)能神经元定向分化的影响及移植对致痫鼠的作用,为神经干细胞进一步研究及临床应用抗癫痫治疗方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

新生 24h内 Wistar乳鼠 2只(佳木斯大学实验动物中心提供),以培养传 3代的神经干细胞为材料设含 10%胎牛血清培养液为对照组、10%胎牛血清培养液分别加 BDNF、红景天苷、BDN F和红景天苷为实验组,培养 3d、7d、14d。红景天苷最终浓度 10 μg/mL通过预实验得。健康的雄性 Wistar大鼠,体重为(220±20)kg;鼠龄 3～ 4个月(佳木斯大学动物中心提供),给以戊四氮腹腔注射,制作大鼠癫痫模型,随机选取造模成功的大鼠 72只分 3组:模型组;移植神经干细胞组;移植神经干细胞+BDNF+红景天苷组。每组分为 7d、14d、21d、28d四个时间点进行观察,每个时间点为 6只大鼠。

1.2 试剂与仪器

红景天苷(编号:110818,中国药品生物制品检定所);BDNF、兔抗鼠 Nestin一抗,兔抗鼠 NSE一抗(北京搏奥森生物技术有限公司);Brdu试剂、驴抗鼠 Brdu一抗、兔抗鼠GAD65一抗(武汉搏士德生物工程有限公司);EGF、bFGF(U◦ S◦ A)等;胎牛血清 (国产);倒置荧光显微镜(重庆蔡康公司),TC2323型二氧化碳培养箱(美国 Sheldon公司 ),单臂脑立体定向仪(M P8000)深圳市瑞沃德公司,微量进样器(10ul)上海激光医学仪器厂等。

1.3 神经干细胞的培养及鉴定

利用无血清培养技术,在体外进行培养及传代后,进行神经干细胞 Nestin免疫荧光鉴定 Nestin鉴定成功后,将传 3代的神经干细胞接种于六孔培养板中,分 4组,每组 6孔。各组细胞分别用含血清、BDN F、红景天苷、BDNF和红景天苷培养液培养,各自培养 3d、7d、 14d,然后进行 Brdu、NSE、GAD65免疫荧光鉴定(Brdu用 FITC免疫荧光法显色为绿色,N SE、GAD65用 Cy3免疫荧光法显色为红色),方法同Nestin鉴定。

1.4 分化率的计算

同一视野下分别对 Brdu/NSE、Brdu/GAD65阳性细胞和明视野下的总细胞计数、分化率为 Brdu/N SE、Brdu/GAD65阳性细胞数 /明视野下的总细胞数,同一张片子选取四个不同视野,取平均值。

1.5 癫痫大鼠模型成功的判定

发作分级参照 Racine分级标准[1]达标准后均停止给药。Racine分级标准为:0级无惊厥,1级面部痉挛,二级面部痉挛+节律性点头,3级面部痉挛节律性点头前肢阵挛,4级面部痉挛+节律性点头前肢阵挛后肢站立,5级面部痉挛节律性点头前肢阵挛后肢站立跌倒,达到三级为入选标准。

1.6 神经干细胞移植

移植时间为大鼠癫痫模型制作后 4～ 5d,方法为用微量注射器行大鼠左侧大脑海马 CA3区注射移植,参照包新民[2]著《大鼠脑立体定位图谱》,将微量注射器针头定位于靶点上方,缓慢进针,到靶点后,每次计量为 5μL,注入时应缓慢注入(＞ 5min),含细胞量为 5×106个 /μL,模型组不予移植。术后实验动物在动物房内正常饲养,所有大鼠在神经干细胞移植手术后均不用免疫抑制剂。

1.7 移植前后癫痫大鼠的行为学观察

所有癫痫大鼠在制作模型后 ,先采用 Racine分级标准法进行癫痫的发作次数和级别的观察。在大鼠进行神经干细胞移植治疗后,(即移植后 1w、2w、3w、4w)两次采用 Racine分级标准法对大鼠进行癫痫发作的观察,具体方法同上。

1.8 统计学分析

计数资料用i2检验,计量资料(±s)多组间比较用方差分析,两两比较用q检验,所有数据用 spss11.0统计分析软件处理及 Excel2003软件处理,P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Brdu/NSE阳性分化率比较

组内比较:BDN F组、红景天苷组 Brdu/NSE阳性分化率 7d与 3,14d相比差异有统计学意义 (P＜0.05),BDNF和红景天苷组 Brdu/NSE阳性细胞分化率 7、14d与 3d相比差异有统计学意义 (P＜0.05)。但 7d和 14d比无统计学意义;组间比较:红景天苷组、BDNF和红景天苷组在 7、14d与对照组、BDN F组比差异有统计学意义 (P＜0.05),其中BDNF和红景天苷组 14d的分化率明显高于红景天苷组,具有统计学意义 (P＜ 0.05)。见表 1。

2.2 Brdu/GAD65阳性分化率

组内比较:BDNF组 7d与 3d比较差异有统计学比较(P＜0.05),BDN F和红景天苷组 7、14d与 3d相比差异有统计学意义 (P＜0.05),而 14d与 7d比差异有统计学意义(P＜0.05);组间比较:7dBDNF组、BDN F和红景天苷组与其他两组相应时间点比较差异有统计学意义 (P＜0.05),而前两者之间比较无统计学意义,BDNF和红景天苷组 14d与其他三组相对应时间点比较差异有统计学意义(P＜ 0.05)。见表 2。

2.3 移植后大鼠癫痫发作次数比较

N SCs+BDNF+红景天苷组分化率最高为筛选组,给予进行癫痫大鼠移植。癫痫发作次数的比较见表 3,发作次数以一周内单位动物癫痫发作次数的均数计算,前两周各组癫痫大鼠发作次数都有所减少,但差异无统计意义。在第三周时,NSCs+BDN F+红景天苷组移植组大鼠癫痫发作次数较模型组和 NSCs移植组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05),在第四周,NSCs+BDNF+红景天苷移植组大鼠癫痫发作次数较其他的组明显减少,有统计学意义(P＜0.05),说明 N SCs+BDNF+红景天苷共移植后能降低大鼠癫痫发作次数。

表 1 各组不同时间点的 Brdu/NSE阳性分化率(%,±s,n=6)

表 1 各组不同时间点的 Brdu/NSE阳性分化率(%,±s,n=6)

注:#组内比较 P ＜0.05。△:组间比较 P ＜ 0.05。△△:与红景天苷组 14d时比较 P ＜ 0.05。

时间(d) 对照组 BDNF组 红景天苷组 BDNF和红景天苷组3 11.506± 0.35 11.502± 0.60 11.160± 0.462 11.128± 0.501 7 12.386± 1.795 12.577± 0.851# 14.796± 1.466# △ 15.586± 1.410# △14 12.169± 0.715 12.276± 0.960 13.627± 1.186△ 15.912± 1.546# △△

表 2 各组不同时间点的 Brdu/GAD65阳性分化率(%,±s,n=6)

表 2 各组不同时间点的 Brdu/GAD65阳性分化率(%,±s,n=6)

注:#组内比较 P ＜ 0.05。## :与 BDN F组 3d时比较 P ＜ 0.05。##:与 BDN F和红景天苷组 7d时比较 P ＜ 0.05。△ :组间 P ＜ 0.05。

对照组 BDNF组 红景天苷组 BDNF和红景天苷组时间(d)10.119± 0.812 10.621± 0.300 10.392± 0.395 10.588± 0.289 7 10.318± 0.821 11.201± 0.311## △ 10.629±0.536 11.859± 0.624# △14 10.622± 0.435 10.790± 0.281 11.081± 0.371 12.758± 0.708## △3

表 3 移植后大鼠癫痫发作次数比较(±s,n=6)

表 3 移植后大鼠癫痫发作次数比较(±s,n=6)

注:*与模型组相比较 P＜0.05。◆与 N SCs移植组比较 P＜0.05。▲与 NSCs+BDN F+红景天苷组 3w比较 P＜0.05。

组别1w 2w 3w 4w模型组 4.33± 1.03 3.67± 1.03 3.33± 0.52 2.83± 0.75 N SCs组 4.17± 0.175 3.67± 0.82 3.12± 0.75 2.17± 0.75 N SCs+ BDNF+红景天苷组 4.00±0.89 3.50±0.84 2.33±0.82*◆ 0.83±0.91*◆▲

3 讨论

在体内及体外大量研究表明,神经干细胞具有多分化功能,但神经干细胞的定向分化研究才刚刚起步,GABA是中枢神经系统中重要的抑制性氨基酸,神经干细胞治疗癫痫的最主要的一个机理就是增加抑制性神经元(GABA神经元)的数量,以此来恢复谷氨酸与 r-氨基丁酸之间的平衡,从而减少癫痫的发生。谷氨酸脱羧酶(GAB65)是 GABA能神经元的生物合成限速酶,主要存在于该神经元的轴突末梢内[3],有研究发现,GABA能神经数目变少,则胞内 r-氨基丁酸的释放量也降低,GAD活性也受到抑制,所以本实验用GAD65作为 GABA能神经元的标记物,进行 GABA能神经元鉴定。

BDNF属于神经生长因子家族或神经营养素家族中的一员。BDNF不仅是在维持神经元正常的生理功能起着关键作用,而且在中枢神经系统的发育过程中对神经元的生存、分化、生长也起着极为重要的作用。 Viario-AbeJ ó n等[4]研究表明 ,BDNF可使 E16海马区 bFGF反应性神经干细胞分化为 GABA能神经元的比例增高。另外谢青松[5]等人的实验可以得知,BDNF还有促进 bHLH基因表达作用,有利于神经干细胞的定向分化。也有人研究发现,一些中药成分也具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。其中主要有红景天苷,红景天苷是中药红景天的主要有效成分,张维烨[6]等通过研究红景天苷对神经干细胞作用的研究证实,红景天苷在体外可以促进神经干细胞向神经元分化。研究也发现,红景天及其提取物在很多方面对神经系统都有着作用,红景天苷可以通过抑制细胞的钙离子超载,降低神经细胞凋亡[7]。另外红景天苷可以通过增加大鼠嗅球当中的 bFGF以及海马中神经生长因子的数量,进而提高大鼠的学习以及记忆能力[8,9]。

本实验结果提示,在体外,BDNF与红景天苷联合有利于神经干细胞向神经元方向分化,此外二者联合有利于GABA能神经元分化;同时二者联合移植致癫鼠后能减少大鼠癫痫发作的次数。其机制可能是因为红景天苷通过抑制细胞内钙离子超载而降低神经细胞凋亡[7],从而减少海马区受损神经元的死亡。有研究也发现 BDN F能显著抑制惊厥发作后的神经元坏死和凋亡[10]。可能是在两者的共同作用下,使癫痫发作后的神经元死亡数量大大减少。另外红景天苷能增加 bFGF海马中神经生长因子的数量,而 bFGF通过提高NSCs分裂,而增加移植到体内的神经干细胞的数量,并促使NSCs向神经元方向分化。同样 ,大量研究显示 BDN F可诱导神经干细胞向神经元尤其是 GABA能神经元分化并促进其成熟。两者联合神经干细胞移植后,可能是在体内红景天苷大大增加了 BDNF的数量,从而使 GABA能神经元明显增多,从而对癫痫发作产生的抑制作用,但是具体机制仍有待进一步研究,随着神经干细胞移植治疗神经系统疾病的不断进展,在癫痫治疗上一定会取得更好的结果。

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