吉林省常见的几种委陵菜ITS序列比对

2011-04-25，，，，，

长春中医药大学学报 2011年5期

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(1.吉林大学再生医学科学研究所，吉林长春 130021；2.长春中医药大学，吉林长春 130117；3.吉林省肿瘤医院，吉林长春 130012；4.吉林省中医药科学院，吉林长春 130021；5.吉林大学第一医院，吉林长春 130021)

委陵菜(Potentillachinesis)为蔷薇科委陵菜属植物，具有清热解毒，凉血止痢之功能[1]。由于疗效确切，在《中国药典》历版中均被收载[2]。该属植物较多，仅吉林省境内就有10种之多。由于它们的亲缘关系接近，在同一生境内或不同生境内生长的各个物种间从外观上很难区别，加之所含化学成分接近，因而，用传统的外观鉴别，显微鉴别，薄层色谱鉴别很难达到满意效果[3],导致误采，误用，影响疗效。为此,我们采用ITS序列分析，对我省地产委陵菜属植物进行鉴别，以弥补上述方法的不足。

1 材料与方法

1.1 材料委陵菜，伏委陵菜，小叉叶委陵菜，霉叶委陵菜，蔓委陵菜为硅胶快速干燥的叶片。分别采集于长吉高速公路和长春南湖公园处。均由长春中医药大学邓明鲁教授鉴定(见表1)。

1.2 DNA提取称取0.3 g各样品叶片，置于培养皿中，加水少许，浸泡至充分展开，剪去病斑，用棉球擦拭叶片，去除杂质，再用70%乙醇擦拭叶片表面，然后用超纯水清洗3次，置于超净台上干燥;在液氮中研磨成细粉，然后按说明用北京鼎国植物基因组DNA提取试剂盒提取其总DNA，溶于适量的超纯水中。取5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA质量和数量。

1.3 引物设计选择被子植物ITS通用引物[4],由宝生物(中国大连)合成，其序列如下：

PCR引物：ITS-F:5→-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3→ ITS-R:5→-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3→

测序用引物I:TS-1F:5→-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3→ In-18S-25S-3→R:5→-GAC TCG ATG GTT CAC GGG ATT CT-3→ In-18S-25S-5→F:5→-TCT CGC ATC GAT GAA GAA CG-3→ 18S-25S-3→R:5→-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3→

1.4 DNA扩增扩增采用50 μL体系，其中1.3引物各1 μL，模板各5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，Taq DNA多聚酶1 μL，超纯净水32 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min。94 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72 ℃2 min,循环35次。72 ℃延长循环10 min，4 ℃保存。

1.5 测序 1.4 PCR产物经Montage PCR Filter Units (Millipore Corporation，U.S.A.)纯化后，进行测序反应。反应采用10 μL体系，用ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，U.S.A.)测序,其中含5×sequencing buffer 2.0 μL BigDye(3.1)0.5 μL,纯化模板1.0 μL，1.3引物1.0 μL，纯净水5.5 μL。反应条件：预变性96 ℃ 1 min。96 ℃ 30 s，50 ℃ 5 s,循环25次。60 ℃延长4 min。

1.6 序列分析采用网页http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html和Genetyx-SV/RC version 11.0 (Software Development Co.，Ltd.，Tokyo，Japan) 进行序列的比对和编辑。