北京地区结缕草锈病流行规律及种质抗病性鉴定

张露明，方 程，张学勇，王兆明，王赟文

(1.中国农业大学动物科学技术学院草业科学系，北京 100193； 2.辽宁大学生态环境研究所，辽宁 沈阳 110036；3.辽宁省岫岩满族自治县草原监理站，辽宁 岫岩 114300)

结缕草(Zoysiajaponica)作为一种优良的暖季型草坪草已经广泛应用于运动场草坪、高尔夫球道、休憩草坪、城市绿化及水土保持等领域[1-3]。结缕草喜温暖湿润气候，叶片厚硬而近革质，耐高温、有一定的耐荫性、耐寒、耐旱，在严重干旱条件下变黄；但在紧接着浇水或下雨的条件下即可恢复，结缕草有深的根茎系统, 可以吸收更深层土壤的水分[4-6]。据报道，结缕草对于病虫害具有较高的抗性，尽管为一定数量的病原物所危害，但其受病原危害的报道较其他草坪草更少[7]。已报道结缕草的病害有锈病(Pucciniaspp.)、黄叶病(Fusariumacuminatum)、春季坏死斑病(Rhizoctoniaspp.)和圆斑病(Sclerotiniahomoeo-carpa)、叶斑病(Bipolarishawaiiensis)等[8-10]。当空气湿度较大，有露水或频繁降雨后，植株叶片表面覆有水膜时，结缕草草坪比较容易受到锈病的侵害，对草坪质量造成较大的影响。结缕草锈病主要由结缕草柄锈菌(Pucciniazoysiae)引起[11]。何秋等[12]在南京地区对结缕草属(Zoysiaspp.)种质材料锈病发病规律的研究表明，结缕草全年有4个发病高峰，其中6月中旬、7月中旬和8月上旬分别有3个发病小高峰，而10月下旬达到发病大高峰，而且感锈病性状在结缕草属种间及种内不同植株材料之间存在显著差异，使得结缕草属抗锈病遗传及抗病品种选育成为可能。

结缕草在我国北方城市如北京、沈阳等也有较大面积的种植利用，锈病也是生产中遇到的主要病害之一。然而，北方地区结缕草锈病的发病规律及种质材料抗锈病评价还鲜有研究报道。为此，本研究于2008-2009年在北京地区进行了对结缕草锈病病原物的鉴定，调查了结缕草锈病流行规律，并且通过田间发病和温室接种2种方法，对收集的结缕草植株种质材料进行抗锈性评价和筛选，为进一步深入进行抗锈病分子标记和抗病品种选育提供依据。

1 材料与方法

1.1试验地点与材料 2008-2009年，在中国农业大学上庄试验站进行了结缕草锈病发病调查及田间评价。该试验站位于北京市海淀区上庄镇辛力屯村东，115°50′ E，40°02′ N，海拔50 m，属暖温带大陆性季风气候，年平均气温为11.4 ℃，绝对最低温为-21.7 ℃，绝对最高温为41.6 ℃，年平均降水量628 mm，全年无霜期211 d。

试验材料有162份，是从山东省胶州市、辽宁省岫岩县、安徽省滁州市等地采集的营养体植株，各材料的编号和数量见表1。

表1 参试结缕草种质材料编号及来源

1.2试验方法

1.2.1锈病病原菌鉴定 田间观察并记录发病植株及叶片症状，夏孢子及冬孢子堆的特点，使用显微镜鉴病叶上的夏孢子、冬孢子，用测微尺测量其大小，分别描述其形态特征对照《中国真菌志(第十卷)》[13]确定病原菌种类。

1.2.2病害流行规律及发病程度调查 2009年5月初开始，每隔3 d左右观察田间初始发病时间，记录夏孢子以及冬孢子出现时期。发病后每隔7 d调查一次，每株随机选取100片叶片进行分级调查，计算病叶率和病情指数。分级标准参考结缕草锈病分级标准[9]，分为如下5级：Ⅰ级，叶片上无夏孢子堆(冬孢子堆)，代表值0；Ⅱ级，叶片上仅具有稀疏的夏孢子堆(冬孢子堆)，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染叶片面积占总叶面积的10%以下，代表值1；Ⅲ级，叶片上夏孢子堆(冬孢子堆)密度中等，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染叶片面积占总叶面积的10%～30%，代表值2；Ⅳ级，叶片上夏孢子堆(冬孢子堆)数较多，叶尖变黄枯死，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染叶片面积占总叶面积的30%～60%，代表值3；Ⅴ级，叶片上夏孢子堆(冬孢子堆)密集、叶片大部分发黄、叶尖枯死，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染叶片面积占总叶面积的60%以上，代表值4。

病情指数按单株计算，根据生长季各品种材料感染锈病的病情表现，获得锈病发病动态图。

在锈病发展高峰期，根据单株发病程度和普遍率对各参试材料的单株进行病情程度目测打分，分值为0～7分，0分表示未发病；1分，0～5%；2分，5%～10%；3分，10%～20%；4分，20%～40%，5分，40%～60%；6分60%～80%；7分，80%～100%。

1.2.3抗病性评价

(1)田间抗病性评价。参照《小麦条锈病测报标准》[14]，记载成株反应型、病叶率及病情指数，反应型分0(免疫)、0；(近免疫)、1、2、3、4六级。0(免疫)：叶片上不产生任何可见斑状。0；(近免疫)：叶片上产生小型枯死斑，不产生夏孢子堆。1(高度抗病)：叶片上产生枯死条点或条斑，夏孢子堆很小，数目很少。2(中度抗病)：夏孢子堆小到中等大小、较少，其周围叶组织枯死或显著褪绿。3(中度感病)：夏孢子堆较大、较多，其周围叶组织有褪绿现象。4(高度感病)：夏孢子堆大而多，周围不褪绿。

(2)温室接种评价。根据2008年初步观察结果及田间调查发病程度数据选取材料SD-1单株10份，SD-2单株11份，SD-3单株10份，AH-1单株5份，LN-1单株7份，共计43份单株，用塑料花盆(直径15 cm，高20 cm)培养健康植株，每盆栽种3个带芽地下茎，重复2次。采集田间各材料上夏孢子，等量混合后备用。傍晚时分，在温室内采用孢子悬浮液涂抹法，用无菌水将夏孢子堆配成悬浮液，于低倍镜下观察每视野50～60个夏孢子，每单株接种1盆，每盆接种10片叶片，另取一组不接种夏孢子为对照。套袋、喷雾保湿，24 h后，拿掉塑料袋，室内温度控制在21～25 ℃。接种10～15 d后进行抗性鉴定，记载单株反应型。

2 结果与分析

2.1锈病症状及病原菌鉴定 结缕草成株锈病发病初期，叶片上病症不明显，随后迅速出现黄色或鲜黄色夏孢子堆。夏孢子堆散生，点状、长条形或椭圆形，长0.1～3.5 mm，凸起，被叶表皮覆盖，成熟后表皮破裂而外露并散发出黄色粉末(图1)。发病严重时，叶面布满夏孢子堆，叶片黄化枯死。

冬孢子堆主要着生叶背面，少数生于叶面，黑褐色或棕褐色，散生，椭圆垫状，长0.3～2.1 mm (图1)。

夏孢子黄色或鲜黄色，椭圆形或倒卵形(13～24)μm×(11～19) μm，壁1～3 μm，个别孢子顶端壁加厚，但是与孢子大小无关(图1)。

图1 结缕草锈病孢子堆及单孢子形态

冬孢子棕色或栗褐色，双胞，椭圆形，具长柄，表面光滑，两端圆或基部稍缢缩，隔膜处稍缢缩或不缢缩(图1)。冬孢子侧壁1～4 μm，顶端增厚4～7 μm，冬孢子柄长度可达90 μm。

根据结缕草锈病田间症状、病原菌的基本生活规律并结合光学显微镜下病原菌的形态特征，对照《中国真菌志(第十卷)》[13]检索表，确定病原菌为结缕草柄锈菌。

2.2田间锈病流行规律 据2009年观测，自5月下旬开始，参试材料当中，个别结缕草植株叶片正面出现非常小的点状橙黄色夏孢子堆，多数位于叶缘部位，孢子堆周围无明显病斑。经过4～7 d，发病部位逐渐隆起，而后表皮破裂产生大量的成熟的黄色粉末状夏孢子。大部分参试材料在6-7月底陆续发病。夏孢子通过风力传播，不断进行再侵染，导致田间锈病大规模流行。9月中旬开始，大部分材料叶片背面或从夏孢子堆中开始逐渐出现黑褐色冬孢子堆，部分材料未出现冬孢子堆。

2009年，参试的162份种质材料单株的田间锈病的发病率为100%，平均病叶率为16.9%，平均病情指数为4.65。从生长季锈病发病动态分析，北京地区结缕草锈病发病呈单峰型的发病特点(图2)。在5-8月初发展缓慢。随着8月份降雨增多，空气湿度变大，成熟夏孢子不断再侵染，病情发展迅速，至9月中旬开始病情进入高峰期，尤其是单株周围匍匐茎上新长出叶片感病严重，部分严重感病的材料叶片上锈孢子堆甚至层层叠起，全株呈现枯黄色。全年病情指数高峰发生在9月中旬-10月上旬。10月下旬气温骤降，植株逐渐进入枯黄期，病情指数显著降低，至11月下旬锈病病害基本停止发展。

锈病发病高峰时期在不同来源的种质之间存在一定差异(图2)。LN-2材料病情指数在8月初发展迅速，8月底有一个发病小高峰，9月初稍有回落，而在9月底达最高峰，其平均病情指数为5.54，最高可达19.06。该参试材料采集自辽宁大学校园已种植10余年的结缕草草坪，表现出对锈病具有易感性。胶东青结缕草群体SD-1材料，锈病发病过程较为缓慢，在10月初达到高峰，高峰期持续1周。野生材料LN-1和AH-1病情指数分别为4.89和4.81，均高于平均水平。而人工选育材料SD-2及优良野生材料SD-3病情指数较低，分别为4.15和4.05，且全年都只有一个病情高峰期。

图2 2009年结缕草全年病情指数发展曲线

在2009年9月下旬，田间锈病发病高峰时期，通过田间目测打分的方法调查各材料单株发病程度，由图3可见参试材料之间锈病发病程度存在明显差异，而参试材料内单株之间发病程度也存在显著差异(表2)。总体来看，评分为4～6分的占全部材料的72.2%，即大部分单株锈病发病程度在20%～60%，材料SD-1、SD-2和SD-3单株锈病发病情况评分包含各个分值范围，尤其是SD-2和SD-3的发病变异系数达70.5%和77.0%，这些参试材料群体当中既有发病程度较高的单株，又有发病程度较低的单株，说明这2组材料中可能存在表现为抗病和感病的单株，群体中抗锈能力具有丰富的遗传变异。其中SD-3中评分为1分的的材料有4份，占该群体单株总数的10.8%，表明SD-3中可能存在较为丰富的抗锈病种质。而材料AH-1、LN-1和LN-2内单株评分都是3分以上，发病程度均高于10%，AH-1和LN-1大部分单株为5～6分，而LN-2中多数单株更高，为6～7分，且群体发病程度变异系数相对较低，进一步说明这些材料受锈病危害程度普遍较为严重。

图3 不同品系结缕草发病程度分布(目测)

2.3抗性鉴定 从田间抗性结果鉴定来看，供试162个材料，其中表现免疫或近免疫(0～0；)的有4个，占供试材料的2.5%，高抗品系9个，占材料总数5.6%，中抗品系17个，占材料总数10.5%，中感品系100个，占材料总数61.7%，高感品系33个，占材料总数20.4%，见表3。根据田间抗感类型，分别选择材料SD-1、SD-2、SD-3、AH-1和LN-1中具有代表性健康植株移植到温室进行室内鉴定，以进一步验证田间抗性鉴定结果。

表2 不同品系结缕草发病程度比较分析

室内接种材料共43株，对照组未接种夏孢子材料均未出现感染锈病症状，而接种锈病夏孢子材料出现了不同感病程度。通过对发病材料锈病抗性鉴定表明，反应型与田间观测结果基本一致的材料有29株，占67.4%。其余材料与田间观测结果不一致，除1株温室内接种评价结果较田间观测病情指数低以外，其他13株材料温室接种病原菌后，发病程度比田间观测严重。温室接种评价的43株材料当中，表现为免疫或近免疫的有2株，高抗病的5株，中抗的7株，表现为中感有13株，高感的16株。材料SD-2中编号为11-1、11-2的单株在田间及在温室中接种后病部产生褪绿斑，不产生或极少产生夏孢子堆，表现出对锈病免疫或近免疫，而编号为2-8、14-1的单株在2种方法的抗性鉴定中均出现大量夏孢子堆，且叶片上不出现褪绿斑，将其鉴定为高感，由此可看出同一材料中，结缕草对锈病的抗性反应不同，具有较好的抗锈筛选基础，可进一步深入抗性差异的遗传研究。

3 讨论与结论

通过对北京地区结缕草6个参试材料162个植株锈病发病规律、病原菌收集与鉴定，以及植株抗病性评价，确定结缕草叶锈病主要是由结缕草柄锈菌造成，与何秋等[12]在南京地区结缕草属锈病病原菌的鉴定结果一致。结缕草柄锈菌为专性寄生菌，当温度适宜且叶片表面覆有水膜时，病菌易于入侵结缕草叶片。调查发现结缕草锈病夏孢子堆主要呈条型或椭圆型，夏孢子堆周边出现的长形水渍状斑块显示夏孢子无法穿过叶脉。Martin和Pierre[15]通过电镜分析认为造成该结果是由于结缕草柄锈菌菌丝无法进入结构组织、泡状细胞或维管束周围细胞壁加厚的细胞，病菌只在叶肉细胞间生长，通过吸器获取营养物质。因此，真菌菌丝沿叶脉延伸形成了狭长的结构，而后叶片表皮破裂散发出粉末状夏孢子，孢子堆长度由1～2 mm到3～4 mm不等。

表3 结缕草抗性鉴定比较(实际测定)

北京地区结缕草锈病夏孢子堆始发期集中在6月初-7月中旬，发病期较南京晚1个月左右，这可能与两地的地理环境、各年份的气候因素不同有关，同时不排除各年份流行的锈病生理小种有所不同。锈病直至7月下旬在个别单株上仍有发病，初次侵染时期延续的时间较长。另外刘建秀等[16]报道结缕草的抗病虫性与种子产量呈极显著负相关，即种子产量较高的种易受锈病侵染，这是由于结缕草种子成熟期较早，种子生产削弱草坪生命力，而使其在后期易受病虫害侵袭。结合调查结果可见北京地区结缕草锈病初侵染防治关键时期在5月中下旬，此时可有针对性的对草坪进行病害管理。可施用药剂如15%三唑酮可湿性粉剂200倍液，97%敌锈钠原药250～300倍液等，第1次施药后，隔7～10 d再施1次，共2～3次[17]。同时注意适时合理灌溉，尽量减少叶片表面长时间湿度较高，以抑制病菌的萌发和侵染。随着气温的上升和湿度增加，9月上旬病情迅速上升，因此在8月采取修剪或化学药剂处理，可有效控制锈病病情发展。9月中旬结缕草叶片背面或夏孢子堆中开始逐渐出现黑褐色冬孢子堆，大部分材料冬孢子堆在9月下旬-10月中旬出现，冬孢子堆附着在植株残体上越冬成为来年病害来源。陈林珍和陈礼琢[18]通过田间调查发现冬前修剪可推迟草坪锈病发病期，减轻病害发生的严重程度。可见入冬前草坪修剪是减少春季病源的重要措施，在入冬前进行草坪修剪并清理病叶，会使翌年病源数量减少，有效降低锈病对结缕草草坪的危害程度。

培育优良的具有抗锈病性状的结缕草品种是锈病防治的根本方法。培育抗病品种的前提是获得抗性种质材料。本研究收集了162个我国主要分布的结缕草种质材料，通过田间抗锈性鉴定筛选和室内接种锈菌抗性鉴定的对比检验，发现室内接种与田间鉴定结果基本一致，说明室内接种鉴定能基本反映出不同材料的抗性，这与何秋[19]对14份结缕草属材料抗性鉴定研究得出的结论一致。由于接种温湿度、光照、接种浓度、叶位、叶龄、接种部位及病原菌的保存时间等因素影响，室内接种与田间调查鉴定结果仍有一定出入，而锈菌是一种气传病害，气候及环境因素对发病有较大影响。因此先进行室内接种，再结合田间鉴定能更为真实的反应结缕草抗病性。本研究通过2种方法的比对初步确定了3个具有抗锈遗传多样性的材料群体SD-1、SD-2和SD-3，并进一步筛选出14个表现为抗病的单株和29个表现为感病的单株。结缕草是一种异花授粉植物，品系间及品系内对锈病的抗性遗传多样性可能与其经过多次杂交而具有较为复杂的遗传背景有关。基于本研究结果，可将抗病单株随机杂交混合繁殖成一个具有综合抗性的群体，在此基础上进行轮回选择，从而培育出具有优良抗锈性的品种。同时可建立抗病及感病亲本群体，通过进行遗传学及分子生物学研究，进一步筛选和定位结缕草抗锈病基因，这将有利于深入研究结缕草抗锈病的遗传机制和筛选出相关分子标记，并使其应用于抗病分子标记的辅助选择育种中。

我国是全球结缕草分布最广泛、储蓄量最大的国家, 也是向国外出口结缕草种子的唯一国家, 在我国草坪业的发展过程中, 引种也起到了一定的作用。关于结缕草的资源开发利用与研究方面, 国内已做了大量工作, 这为今后的育种工作奠定了良好的基础。分子标记技术(RAPD、RFLP和AFLP)也已在结缕草种质资源研究上得到应用，尤其是近年来SSR、EST-SSR、SRAP[20-21]等分子标记在结缕草上的开发和应用越来越广泛深入，除了传统育种技术外，新型的分子标记辅助选择育种技术将加快国内结缕草新品种的选育。

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