蒲公英决明子(PJ)滴眼液的指纹图谱研究

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(1.南京中医药大学附属江苏省中医院，江苏 南京 210029;2.南京医科大学附属南京市妇幼保健院，江苏 南京 210004)

蒲公英决明子滴眼液(简称PJ滴眼液)是以中药蒲公英为君药的中药复方制剂，具有清热明目、消肿解毒的功效，临床用于治疗角膜炎、结膜炎等眼部疾病，疗效显著，由江苏省中医院制剂部提供，正准备申请国家六类新药。 蒲公英性味苦、甘寒，归肝、胃经，有清热解毒、消痈散结、利湿通淋作用。临床应用时以鲜品为佳[1]。原植物：蒲公英属(TaraxacumWeber)植物多分布于北半球温带和亚寒带地区，全世界约数百种[2]。 蒲公英具有广谱抗菌药理作用：蒲公英的热水提取物(1 g/mL)可使金黄色葡萄球菌的细胞膨大，细胞壁增厚，核糖体聚集成块，有的细胞壁破裂，胞质渗出。说明蒲公英的抗菌作用机制是一方面通过抑制细胞壁合成，另一方面是通过抑制蛋白质和DNA的合成来实现的[3]。刘本燕等[4]研究结果显示蒲公英单味提取物对肿瘤细胞的体外体内增殖有明显抑制作用，提示对肿瘤的治疗可能有一定的应用价值。

决明子为豆科植物决明CassiaobtusifoliaL.或小决明C.tora L.的干燥成熟种子，具有清热明目、润肠通便的功效，用于治疗目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结等[5]主要含有多种蒽醌类成分[6]决明子的乙醇提取物及氯仿提取物对多种细菌均有抑制作用。程玲铃等[7]用中药决明子的乙醇提取物及氯仿提取物对核盘菌等10余种植物病原菌进行抑菌活性筛选研究。结果表明决明子对植物真菌病原的抑制作用强于对植物细菌病原菌。

目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段，用它来评价中药材及其制剂的质量已成为我国中药研究的热点之一。本试验采用高效液相色谱法测定了10批PJ滴眼液的指纹图谱，建立了PJ滴眼液的指纹图谱分析方法。结果表明该方法可靠、稳定、重现性好，适用于PJ滴眼液的质量考察。

1 仪器与试药

Waters 515高效液相色谱仪(515 HPLC Pump，美国Waters公司)；Waters 2487双波长紫外检测器(Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector，美国Waters公司)；Waters 2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector(美国Waters公司)；2002 Waters Empower pro工作站(美国Waters公司)；KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);岛津AY-200电子分析天平(日本岛津公司)；TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂)；色谱柱:Kromasil C18(4.6×200 mm,5 μm，中科院大连化学物理所)。中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版(中南大学中药现代化研究中心开发，国家药典委员会认可)。

甲醇(色谱醇，山东禹王实业有限公司禹城化工厂，批号：20090429041)；磷酸(分析纯，南京盛跃精细化工发展有限公司，批号：20091014)；甲酸(分析纯，上海久忆化学试剂有限公司，批号20090301)；乙酸乙酯(分析纯，上海申博化工有限公司，批号0907101)；水为自制重蒸水。

咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102，供含量测定用)；十批PJ滴眼液中试样品，见表1。药材均经江苏省中医院中药库朱育凤老师鉴定。

表1 10批PJ滴眼液批号及药材情况

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18(4.6×200 mm，5 μm)；检测波长：290 nm;柱温：30℃；流动相：0.05%磷酸的甲醇溶液-0.05%磷酸的水溶液(梯度洗脱)；流速：1.0 mL/min；分析时间：125 min；进样量：供试品与参照物各20 μL，梯度洗脱条件见表2。

表2 指纹图谱流动相梯度洗脱条件

2.2 供试品溶液的制备 精密吸取10 mL样品溶液,置分液漏斗中，用5%甲酸的乙酸乙酯萃取5次，每次30 mL，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣用含5%甲酸的甲醇溶液溶解并定容至10 mL，摇匀，离心取上清液，即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取在110℃干燥至恒重的咖啡酸对照品7.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 测定方法 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录125 min色谱，记录对照品色谱图见图1。

图1 咖啡酸对照品色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 稳定性试验 取同一批次供试品(批号20091109)，室温下放置，连续进样测定,共进样9次，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大于0.99，表明供试品在测定的20 h内可保持稳定。

2.5.2 精密度试验 取同一批次供试品(批号20091109)，连续重复进样5次，考察进样精密度，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大于0.99，表明供试品进样精密度良好。

2.5.3 重现性试验 取同一批次PJ滴眼液(批号20091109)，按供试品的制备方法分别制备5份供试品，平行测定，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大于0.99，表明本法测定的重现性良好。

3 结果

3.1 指纹图谱的建立

3.1.1 特征峰及参照峰的选择 在上述分析条件下，供试品与参照物溶液各进样20 μL，结果10批PJ滴眼液供试品溶液各成分均能得到较好的分离，所有成分的色谱峰在115 min之内全部出现。

咖啡酸峰的保留时间为13.95 min，与PJ滴眼液供试品指纹图谱对应良好。在PJ滴眼液供试品指纹图谱中，咖啡酸峰占总峰面积的百分比平均值约为8.1%。

从色谱图中可以看出咖啡酸峰(RT≌13.95 min)分离较好，积分相对较大，且咖啡酸为君药蒲公英的主要有效成分，具有一定的抗菌、抗病毒作用，与PJ滴眼液临床作用一致，故选择该峰作为参照峰。

3.1.2 特征峰的标定 PJ滴眼液供试品色谱可分离出约50多个峰，经与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图，选取其中13个共有峰作为指纹图谱的特征峰。参照物峰(RT≌13.95 min)标号为S(2号峰)，其它特征峰依次标号为1，3，4，5，……13。

10批PJ滴眼液特征峰保留时间、峰面积见表3、表4。

表3 10批PJ滴眼液共有指纹峰(特征峰)保留时间

表4 10批PJ滴眼液共有指纹峰(特征峰)峰面积

3.1.3 对照指纹图谱的确定 根据10批次供试品HPLC图谱测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参数，进行分析、比较，并借助“中药指纹图谱相似度计算软件”，制定出优化的对照指纹图谱。对照指纹图谱的特征峰保留时间、相对保留时间、峰面积及相对峰面积比值见表5，图2。

表5 对照指纹图谱的特征峰情况

图2 PJ滴眼液对照指纹图谱

3.1.4 共有指纹峰的标定 根据10批供试品测定结果，标定共有指纹峰。PJ滴眼液供试品指纹图谱中，共有指纹峰是13个。与咖啡酸参照物峰相比，其他12个共有指纹峰相对保留时间见表6。

3.1.5 共有指纹峰面积比 5、7、8号共有指纹峰的面积超过总峰面积的10%，根据指纹图谱的相关要求[8]，规定5号峰相对峰面积比值为1.016～1.694，规定7号峰相对峰面积比值为1.038～1.730，规定8号峰相对峰面积比值为1.094～1.824。共有指纹峰相对峰面积比值见表7。

表6 10批PJ滴眼液共有指纹峰(特征峰)相对保留时间表

表7 10批PJ滴眼液共有指纹峰(特征峰)相对峰面积比值表

表8 10批PJ滴眼液相似度比较结果

3.2 指纹图谱相似度评价 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，通过“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，得到各批次PJ滴眼液指纹图谱数据。结果10批相似度均为0.90以上，见表8。

4 小结

4.1 在检测过程中发现，柱温对各色谱峰的保留时间影响较大。其原因可能是流动相的组成中加有磷酸，柱温通过影响流动相中pH值而影响色谱峰的保留时间，所以在检测过程中最好要严格控制柱温，使该滴眼液的指纹图谱检测更加稳定，重现性更好。

4.2 本文采用HPLC色谱法，初步建立了PJ滴眼液的指纹图谱分析方法，结果表明此方法稳定，可靠，重现性好，适用于PJ滴眼液的质量考察。

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