野生马蹄金花粉生活力检测方法比较

2011-04-25刘帮龙张晓慧干友民贺啸尘

草业科学 2011年11期

刘帮龙，张晓慧，干友民，贺啸尘，莫利

(四川农业大学草业科学系，四川雅安 625014)

马蹄金(Dichondrarepens)是旋花科马蹄金属的多年生匍匐型草本植物，喜温暖湿润气候，多生于疏林地、林地边缘及山坡、河岸和河滩的阴湿地段，呈片状分布[1-2]。马蹄金属植物在全世界共有13个种，中国仅有1个种，该种主要分布在中国、东南亚及澳洲的一些国家[3]，我国是其分布的中心，主要分布于秦岭-淮河以南的热带、亚热带地区[4-5]。马蹄金植株低矮，叶形美观，须根发达，具较多的匍匐茎，能节间着地生根，建坪容易，管理粗放，适应性广，是目前国内外应用广泛的优良地被兼观赏植物。

花粉是高等植物的雄配子体，它在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、适宜贮存条件以及花粉生活力的适宜测定方法均有所差异[6]。因此，掌握花粉生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。

国内外对马蹄金的研究主要集中在引进品种的形态、生理生态、适应性、栽培管理措施等方面[7-22]。而有关马蹄金花粉活力等有性繁殖特性方面研究报道较少，且多是对生殖物候的初步观察研究，周守标等[23]、干友民等[24]通过观察西南地区野生马蹄金材料生殖物候，发现材料间开花结实性有差异，部分坪用价值较好的材料存在仅开花不结实现象，这将阻碍优异坪用马蹄金品种培育和推广。因此，本试验以前期研究筛选出的坪用价值、抗逆性均表现较好，但结实性不同的野生马蹄金材料SD200303(开花并结实)、GD200503(仅开花不结实)为研究对象，分别以碘-碘化钾(I2-KI)染色法、联苯胺-甲萘酚染色法、2,3,5-氯代三苯基四氮唑(TTC)染色法和离体萌发法测定其花粉活力，比较4种方法测定效果的差异，筛选适宜马蹄金花粉活力测定方法，为进一步研究野生马蹄金有性繁殖特性提供基础资料。

1 材料与方法

1.1试验材料供试野生马蹄金材料采自四川、贵州境内不同生境，采集后移栽至四川农业大学农场资源圃中扩繁；并记录采样点生境条件，植物群落构成情况和土壤类型等。

参考研究小组前期对西南野生马蹄金的坪用、生殖物候等研究结果[15-20]，从14份野生马蹄金材料中，筛选出坪用特性、抗性等均较好，但结实性存在明显差异的材料SD200303(结实)和GD200503(仅开花不结实)。

1.2试验方法

1.2.1碘-碘化钾染色法花期取花药刚开裂野生马蹄金材料花粉粒，将少量花粉置于载玻片上，滴入一滴1%的碘-碘化钾溶液，盖上盖玻片染色，常温下放置20 min后，Olympus显微镜(型号CX21)检查着色情况，统计盖玻片中央部5个视野花粉的着色情况，凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉[25]，计算花粉活力百分率，重复3 次，取平均值。

表1 野生马蹄金材料来源与编号

1.2.2联苯胺-甲萘酚染色法先将0.2 g联苯胺溶于100 mL 50%酒精，0.15 g 甲萘酚溶于100 mL 50%酒精，0.25 g碳酸钠溶于100 mL蒸馏水等量配制成混合溶液 I；接着配制0.3%过氧化氢溶液Ⅱ，然后载玻片上加少量待测花粉，滴溶液Ⅰ和溶液Ⅱ各一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片，经3～4 min后，Olympus显微镜(型号CX21)下检查，统计盖玻片中央部5个视野花粉的着色情况，有生活力的花粉呈红色或玫瑰色，无生活力的花粉为黄色或无色[26]，计算花粉活力百分率，重复3 次，取平均值。

1.2.32,3,5-氯代三苯基四氮唑染色法花期取花药刚开裂的野生马蹄金材料花粉粒，将少量花粉置于载玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液(0.05 g TTC粉末溶解在10 mL pH值7.17的磷酸缓冲液中)，将此载玻片置于恒温箱中(35～40 ℃)15～20 min后镜检，统计盖玻片中央部位5个视野中红色花粉所占的比例[24]，计算花粉活力百分率，重复3 次，取平均值。

1.2.4离体萌发法以培养基离体培养法测定花粉活力，琼脂培养基含蔗糖(设3个梯度：5%、10%、15%)+0.005%硼酸(HBO3)、0.015%硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]+0.001%硫酸镁(MgSO4·7H2O)+0.005%硝酸钾(KNO3)+0.5%琼脂，将配制好的培养基倒入培养皿中待用，花期取花药刚开裂的野生马蹄金材料花粉粒均匀撒在制备好的培养基上，盖盖置于25 ℃暗培养箱中培养，0.5 h后将培养皿置于Olympus显微镜(型号CX21)载物台上观察花粉萌发状况，花粉管长度大于花粉直径视为有活力花粉[24]，观察5个视野，计算花粉萌发率，重复3次，取平均值。花粉萌发率即代表花粉活力。

2 结果

2.1碘-碘化钾染色法多数植物正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。通常正常花粉用碘-碘化钾染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉或积累淀粉极少，当碘-碘化钾染色时呈黄褐色。因此，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。

正常的野生马蹄金花粉粒通常呈球形或椭球型，个体大小近似，自然状态下无色。利用碘-碘化钾染色法测定花药刚开裂供试野生马蹄金花粉生活力，其花粉粒均被染成黄色或黄褐色，未见蓝色，不能根据呈色反应来统计花粉生活力差异，因此，碘-碘化钾染色法不适宜野生马蹄金花粉活力测定(表2)。

2.2联苯胺-甲萘酚染色法具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活力，经联苯胺-甲萘酚染色后，具生活力的花粉含活跃的过氧化物酶，花粉呈红色；活力弱的花粉含过氧化物酶较少，只能催化少量多酚及芳香族胺发生氧化而被染成浅红色；无活力的花粉不含过氧化物酶，因此不能产生催化反应。

联苯胺-甲萘酚染色后的供试材料野生马蹄金花粉在显微镜下呈现红色、浅红色、无色3种颜色反应，对花粉染色情况统计分析表明，GD200503花粉活力为38%，SD200303的花粉活力则为73%，是GD200503的两倍(表2)。

2.32,3,5-氯代三苯基四氮唑染色法凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，使无色的TTC变成三苯基甲臢(TTF)而呈红色。经TTC染色后，供试野生马蹄金材料花粉颜色均无明显变化，未见明显染色反应，且颜色差异小，不易分辨统计花粉活力差异。因此，该方法不适宜野生马蹄金花粉活力测定(表2)。

2.4离体萌发法在不同质量分数蔗糖培养基上，野生马蹄金材料花粉离体萌发率存在差异(表2)，其中SD200303的花粉在蔗糖分别为5%、10%和15%的培养基上均能萌发，在含10%蔗糖培养基上的花粉离体萌发率最高，达54.96%，花粉管生长良好，且花粉萌发率基本稳定，便于观察。而GD200503花粉离体萌发率在蔗糖为5%和15%的培养基中均不萌发，在蔗糖为10%的培养基中有少量萌发，离体萌发率较低，仅为2.43%，这可能与其本身花粉活力低有关，各处理间差异极显着(P<0.01)。因此，野生马蹄金花粉离体萌发较适宜的培养基为蔗糖10%+硼酸(HBO3)0.005%+硝酸[Ca(NO3)2·4H2O]0.015%+硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.001%+硝酸钾(KNO3)0.005%+琼脂0.5%。

2.54种野生马蹄金花粉活力测定方法效果比较综合比较4种花粉活力测定方法的测定结果(表2)，碘-碘化钾法和2,3,5氯代三苯基四氮唑染色法由于染色效果不佳，不易分辨，不利于区分统计花粉活力差异，不适宜野生马蹄金花粉活力测定。联苯胺-甲萘酚染色法能使野生马蹄金花粉粒呈现明显变色反应，利于统计花粉活力，但随着花粉生活力的丧失，该酶活性不消失，仍能染色，其测定结果与离体萌发法比较，测定值往往偏高。与染色法相比，离体萌发法的固体培养基为花粉萌发提供了更好的养分条件，花粉萌发率从开始萌发到在培养0.5 h内，萌发率呈上升趋势，之后基本保持不变。因此，作为快速简便的野生马蹄金花粉活力测定方法，离体萌发法更为可靠，能更加准确可靠地反映花粉活力。

表2 不同花粉活力测定方法测定结果比较

3 讨论

利用染色法测定花粉生活力具有快速简便的优点，但受花粉自身特性(如花粉壁的厚薄，花粉外壁的组成物质，花粉内各种酶活性的强弱等)的影响较大，因此，不同的染色法只适合某些植物花粉生活力的测定。2,3,5-氯代三苯基四氮唑染色法检测花粉生活力是应用较多的，很多植物材料例如锦带花(Weigelaflorida)、芍药(Paeonialactiflora)、刺五加(Eleutherococcussenticosus)的花粉生活力测定都适用[27-29]。碘-碘化钾法测定花粉生活力时，其着色程度受花粉壁的薄厚和花粉内支链淀粉和直链淀粉比例高低决定，如棉花(Gossypiumsp.)花粉用碘-碘化钾染色就不着色[30]。但本试验中碘-碘化钾、2,3,5-氯代三苯基四氮唑对野生马蹄金花粉染色效果不佳，可能由于花粉外壁太厚或花粉内含物中支链淀粉含量较少等原因。

与染色法相比，离体萌发法虽然操作复杂，花粉不易涂抹均匀，耗时长，但花粉萌发测定的数据科学可靠，并可完全定量，几乎适用于所有植物的花粉生活力测定，但不同的材料需要不同的培养基。蔗糖的作用是提供合适的渗透压和花粉管形成所需能量，硼酸的作用是促进花粉管的萌发。本试验比较了在不同蔗糖质量分数条件下野生马蹄金花粉离体萌发情况，筛选出适宜马蹄金离体萌发的培养基配方，为野生马蹄金花粉活力测定提供理论依据。

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