冠心病患者缺氧诱导因子－1α与血红素氧化酶－1的相关性研究

张国红，陈宋明

缺氧诱导因子1α(HIF－1α)是机体细胞在低氧环境中产生的一种转录因子，参与低氧反应基因的调控，可促进血红素氧化酶－1(HO－1)、血管生长因子(VEGF)等因子的表达。HO－1具有抗氧化、抗炎、扩张血管作用，被认为是血管保护因子［1］。研究证实HIF诱导的HO－1对缺血－再灌注损伤具有长期的心肌保护作用［2］。本研究检测冠心病患者外周血单个核细胞HIF－1α和HO－1表达水平，探讨冠心病患者HIF－1α与HO－1表达的相关性，为诱导HO－1治疗冠心病提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择本院2006年4月—2007年12月因冠心病心绞痛或急性心肌梗死入院并在入院后行冠状动脉造影检查确诊为冠心病的患者为研究对象，共95例，其中急性心肌梗死患者35例(AMI组)，其余患者按入院前心绞痛的发作特点分为稳定型心绞痛组(SAP组，劳累性心绞痛发作的性质在1～3个月内无改变)，30例;不稳定型心绞痛组(UAP组，包括除稳定型心绞痛以外的其他类型心绞痛)，30例。选择经冠脉造影证实冠脉正常的30例患者作为对照组。所有研究对象检查前4周无感染、创伤史。同时记录患者的高血压、糖尿病、高血脂及吸烟史。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞的分离 取研究对象外周抗凝血10 m l，用Hank'S液稀释1倍后加于10 ml单个核细胞分离液上(天津中科院生物医学工程研究所)，2 000r/min速度离心20 min，吸取单个核细胞层(主要为淋巴细胞)，用Hank'S液冲洗3次(1 200 r/min)，沉淀物用冻存液－80℃保存，以备行Western blot检测。

1.2.2 Western blot印迹 应用单细胞裂解液裂解单个核细胞，离心后取上清液，利用PCA法测定蛋白含量，以每孔50μg蛋白量用缓冲液缓冲后煮沸5 min，蛋白变性后用微量加液器以每孔50μl加样，稳压60 V在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳4 h，再进行蛋白质的电转移(转移槽60 V转膜3 h)。转膜后丽春红染色5 min，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。将膜泡于含HO－1一抗和HIF－1α的新鲜配制的5%脱脂奶粉溶液中(HO－1一抗为多克隆兔抗HO－1，美国ALEXIS公司出品，稀释度1∶400;HIF－1α一抗为鼠抗HIF－1α单克隆抗体，Warm Springs Blvd Fremont CA出品，稀释度1∶400)，室温下孵育2 h，TGCT液洗膜2次，用同法加二抗(HO－1二抗为羊抗兔IgG，武汉博士德公司产品;HIF－1α二抗为兔抗鼠，Sigma公司产品)，二抗稀释度1∶500，室温下反应2 h。免疫反应后的膜盖于发光试剂(北京中山试剂公司)反应1 min，膜吸干后盖于相应大小的X线片上，暗室暴光5 min，X线片经显影定影后晾干待检。将Wstern blot结果扫描进计算机，再用Sigma pro自动图像分析软件对HO－1光带进行分析，以HO－1蛋白带的灰度峰值代表HO－1的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用(x－±s)表示，组间差异比较采用单因素方差分析及χ2检验，采用相关分析方法分析指标间相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般情况比较 冠心病患者AMI、UAP、SAP组及对照组临床资料及危险因素比较，各指标间差别无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

2.2 Western blot结果 与对照组相比，AMI组、UAP组患者HO－1和HIF－1α蛋白表达均明显增多，SAP组HO－1和HIF－1α蛋白表达增多不明显。相关分析发现，在总体水平上，HO－1、HIF－1α蛋白表达呈正相关(r=0.76);在AMI组、UAP组与SAP组HO－1、HIF－1α蛋白表达也存在正相关(r值分别为0.79、0.89、0.75，P ＜0.01，见图 1，表 2)。

表1 各组研究对象临床资料及冠心病危险因素比较Table 1 The clinical information and risk factors in different groups

图1 各组冠心病患者及对照者HIF－1α与HO－1的表达Figure 1 Expression of HIF－1αand HO－1 in different groups

表2 各组蛋白印迹图像分析结果比较 (x－±s)Table 2 Expression of HIF－1αand HO－1 in different groups

3 讨论

冠心病是威胁公众健康的全球性疾病，其发生、发展有赖于作用于冠状动脉的损害因素和保护因素相互作用的结果。近年研究表明，HO－1是一个血管保护因子，冠状动脉壁HO－1表达水平将直接影响冠心病的发生、发展及预后［3］。本课题组的前期研究已发现冠心病患者HO－1表达水平高于冠状动脉正常者，HO－1表达水平与冠心病严重程度显著相关［4－5］。在此基础上，本研究观察了HO－1上游调控因子HIF－1α蛋白表达情况，并探讨两者的相关性，结果发现HIF－1α蛋白表达也与冠心病严重程度密切相关，且HO－1与HIF－1α蛋白表达间存在正相关关系。

HIF－1α是细胞暴露于缺氧环境后各种病理和生理反应的重要调节因子。HIF－1α在常氧下分解，在低氧下稳定，HIF－1α和HIF－1β都是HIF－1的亚单位，HIF－1β的表达不受细胞内氧浓度的影响，而HIF－1α的表达却直接由低氧诱导。缺氧时，HIF－1α不被分解，并启动包括与HIF－1β聚合在内的多个激活步骤［6］。

HIF－1α参与对低氧反应基因的调控，可以促进VEGF、促红细胞生成素 (EPO)、HO－1等因子的表达。HIF－1α会引起血管新生、血管平滑肌舒缩、抑制血小板凝聚、红细胞增生而缓解冠心病患者心肌缺血［7］。HIF－1α表达上调可以促进致密血管的增生，增加心肌组织血供，减少心肌梗死面积［8］。HIF诱导的HO－1对缺血－再灌注损伤具有长期的心肌保护作用［2］。本研究发现，AMI组、UAP组与SAP组HIF－1α蛋白的表达差异明显，提示HIF－1α蛋白表达与临床表型密切相关，证实了HIF－1α对冠心病患者缺血后心肌的保护作用。

HO－1为可诱导型血红素氧化酶，在缺氧、氧化应激、中毒等情况下表达明显增加［9］。HO－1存在于血液中单个核细胞胞质微粒体，也分布于网状内皮细胞含量丰富的组织如肝脏、脾脏，其他组织细胞在氧化应激状态下也有不同程度的表达。近几年研究表明，HO－1对心血管系统起重要的保护作用:通过抗氧化作用保护血管内皮细胞及心肌细胞［10］;通过调节细胞生长减少内皮细胞凋亡，保护内皮系统的稳定性，同时促进血管平滑肌凋亡，减轻血管损伤后的不良重构;直接抑制心肌细胞肥大，降低左室/体质量比例;催化产生内源性一氧化氮，直接扩张血管。HO－1是体内重要的抗动脉粥样硬化因子之一［11］。众多试验发现HO－1高表达可降低冠心病患者冠脉介入术后再狭窄率［12－13］，其高表达也能降低冠心病死亡率，减少冠脉事件发生率［14］。本研究发现，HO－1的表达在AMI、UAP与SAP组中有明显差异，提示HO－1表达与临床表型密切相关的同时也进一步提供了HO－1表达的上调影响缺血后适应心肌保护作用相关的证据［15］。

本研究结果发现HIF－1α蛋白表达与冠心病严重程度密切相关，提示心肌缺氧面积可能与HIF－1α表达水平相关，检测HIF－1α表达水平可间接反应冠心病严重程度，也反映了机体对缺氧心肌的一种自身保护机制。另外，HIF－1α/HO－1蛋白表达之间存在正相关关系反映体内保护因素之间存在着调控关系，证实了在冠心病发生、发展过程中HIF－1α/HO－1被激活，从蛋白质－蛋白质相互作用角度阐明影响HO－1表达水平的分子机制。本研究证实HIF－1α是冠心病患者内源性保护因子HO－1表达水平的重要调控因子，为诱导HO－1的表达用于冠心病的治疗奠定了基础。

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