昆明地区汉族人vWF基因多态性与急性脑梗死的相关性

刘江翟明张蕾董曼丽张芹赵忠

·论 著·

昆明地区汉族人vWF基因多态性与急性脑梗死的相关性

刘江*翟明*张蕾*董曼丽*张芹*赵忠*

目的 探讨血浆血管性假性血友病因子（von Willebrand factor vWF）表达水平及其基因19内含子MspI（Major surface protease I）多态性与急性脑梗死的相关性。阐明vWF基因19内含子MspI多态性在昆明地区汉族人群中的分布。方法 收集119例急性脑梗死（24 h内）和117名昆明地区汉族健康人为对照，免疫比浊法检测血浆vWF表达水平；聚合酶链反应－限制性片段长度多态性结合MspI酶切技术进行vWF基因19内含子MspI多态性分析。结果 急性脑梗死血浆vWF表达水平为（189.37% ±89.55%）明显高于对照组（P＜0.05）。昆明地区汉族人群中vWF基因19内含子 MspⅠM＋／M＋、M＋／M－和 M－／M－基因型频率分布分别为 0.047、0.377和0.576；M＋／M－等位基因型频率分布分别为0.235、0.765。脑梗死组MspⅠ多态性M－／M－基因型频率高于对照组（P＜0.05）。脑梗死组M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型的循环vWF水平分别为（170.00%±78.67%）、（148.62%±62.58%）和（205.38%±92.68%），各基因型之间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 血浆vWF表达水平及vWF基因19内含子MspⅠ多态性M－／M－基因型与急性脑梗死发生有显著相关性；昆明地区汉族人群中vWF基因19内含子MspⅠ等位基因M＋和M－的分布与其他人群不同。

急性脑梗死 血管性假性血友病因子 基因多态性 MspI酶切位点

在脑梗死的发生中血小板起了促进血栓形成的作用，尤其是血小板的受体与配体对于血小板黏附与聚集功能起到重要调控作用。血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）受体在血栓形成中调节血小板，是缺血性脑卒中的候选基因。当血管内皮细胞受损时，血小板膜糖蛋白（GP）的配体血管性假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）的合成增加并大量释放入血，是目前最具有特征性的血小板活化的分子标志物，可敏感地反映血小板活化程度［1－2］。本研究对昆明地区汉族健康正常人群及急性脑梗死患者血浆vWF表达水平及其基因19内含子MspI多态性进行分析，探讨与急性脑梗死的相关性及vWF基因19内含子MspI基因多态性在昆明地区汉族人群中的分布。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组选取2007年1月至2009年9月我科就诊的急性脑梗死患者（起病24 h内）籍贯为昆明的汉族人119例，其中男56例，女63例；年龄为42～83岁，平均（64.9±13.4）岁。对照组：籍贯为昆明地区汉族健康体检者117名，其中男51名，女66名；年龄为39～84岁，平均（62.4± 11.3）岁。病例组和正常对照组年龄、性别具有可比性均无统计学差异。

1.2 病例组入选标准 急性脑梗死诊断标准符合中华医学会第四次脑血管病学会议修订的诊断标准［3］，经临床、头部CT和／或MRI检查确诊，发病24小时内。

1.3 病例组排除标准 ①潜在的心源性栓子 （包括3周内新发心肌梗塞、房颤、二尖瓣狭窄或机械瓣、扩张型心肌病、病态窦房结综合征及细菌性心内膜炎）；②周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者、大动脉炎、外伤、手术、药物、恶心肿瘤、血管畸形或动脉瘤等引起的脑梗死；③无症状性脑梗死；④患有严重肝肾疾病、感染、甲状腺疾病、凝血功能障碍、血液病；⑤高血脂；⑥抽血前2周内用过阿司匹林、潘生丁、肝素等影响血小板的药物。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 病例组入院当天用抗凝管采静脉血2.7 mL，血与抗凝剂（0.109 mol／L枸橼酸钠）容积比为 9∶1，室温条件下 2500 r／min离心 10 min，小心取出上层血浆－20℃保存，统一测定vWF。对照组在体检时用同样的方法采血。

1.2.2 检测方法 采用法国STAGO公司产全自动血凝仪，免疫比浊法测定。试剂为STA-LIATEST vWF（法国STA公司配套试剂）；用STA-vWF Ag CALIBRATOR进行定标，STA-Liatest Control N＋P完成质控后将标本上机检测。

1.2.3 DNA提取 取空腹静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝。按离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作，采用热启动PCR扩增vWF基因19内含子MspI特异片段，引物设计参考文献资料［4－5］。上游引物：5′-AGGGCTAGATCA GTCACTGTGGCCCT-3′；下游引物为：5′-TGGC CGCGAGCTCCCTCACTCCACC-3′。MspI酶切位点：61CCGGCATGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAA GGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCAAGGA121GTAT GCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACA CTTGGTGAGGCTCAGTGAGGGG，切开部位为C／CGG；研究多态性区域为181CTGCGCCGGGGACC CAGGCCCTGCGTGGCCGCGAGCTCCCTCACTCCAC C。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0进行统计学分析，数据均采用±s差表示，对各组血浆vW值进行单因素方差分析（One-Way ANVOA），组间比较采用Scheffe检验（方差具有齐性）和Tamhane’s T2检验（方差不齐时）。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 血浆vWF表达水平 脑梗死组血浆vWF表达水平（189.37%±89.55%）升高较对照组（84.33% ±33.56%）明显，差异有统计学意义（t＝11.93，P＝0.000）。

2.2 vWF基因19内含子MspI多态性基因型总体频率分布 昆明地区汉族人群中vWF基因19内含子MspI多态性M＋／M＋、M＋／M－、M－／M－、M＋和M－基因型总体频率分布分别为0.047、0.377、0.576、0.235、0.765。脑梗死组中M＋／M＋、M＋／M－和 M－／M－基因型频率分别为 0.059、0.286和0.655；M＋／M－等位基因频率分别为0.202、0.798。对照组中M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－基因型频率分别为0.034、0.470和0.496；M＋和M－等位基因频率分别为0.269、0.731（表1）。

表1 昆明地区脑梗死组与对照组vWF基因19内含子MspI多态性基因型和等位基因频率

表2 病例组与对照组vWF基因19内含子MspI酶切位点基因型及等位基因频数比较

脑梗死组的vWF基因19内含子MspⅠ多态性M＋／M－和M－／M－基因型频率与对照组相比较差异有统计学意义 （P均＜0.05），其M－／M－型频率均高于对照组，M＋／M－基因型频率均低于对照组，M＋／M＋、M＋和 M－等位基因频率在两组间比较差异无统计学意义 （P均 ＞0.05）（表2）。

2.3 vWF基因19内含子MspI等位基因型MspI＋／MspI-的分布 我国汉族人群vWF基因19内含子MspI等位基因型MspI＋／MspI-的分布频率为0.20∶0.80、彝族人为0.26∶0.74、傣族人为0.17∶0.83［5］、高加索白种人为0.33∶0.67［6］。昆明地区汉族人MspI＋／MspI-的分布频率为0.235∶0.765，各等位基因型的分布与国内其他地区人群有一定差异，与白种人群差异较大（表3）。

2.4 vWF基因多态性分布的Hardy-Weinberg检验 应用Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验方法，把观察值与预期值作比较，进行χ2检验。病例组、对照组及总体人群的基因型分布的观察值和预期值差异无统计学意义（P＞0.05），表明它们的基因型频率分布没有偏离Hardy-Weinberg遗传平衡，说明我们所选择的研究人群基因频率能够代表群体的基因分布（表4）。

2.5 vWF基因19内含子MspI多态性基因型和血浆vWF表达水平变化的关系 行单因素方差分析分别比较脑梗死组与对照组三种基因型组间vWF表达水平，脑梗死组M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型的循环vWF表达水平分别为（170.00%±78.67%）、（148.62%±62.58%）和（205.38%±92.68%），各基因型血浆vWF表达水平之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型血浆vWF表达水平分别为（82.00%±24.39%）、（90.77%±30.84%）和（85.19%±33.62%）各基因型血浆vWF表达水平之间比较无统计学意义（P＞0.05）（表5）。

表3 不同地域、不同种族间vWF基因19内含子MspI酶切位点等位基因型分布

表4 vWF基因MspI酶切位点基因型多态性分布Hardy-Weinberg检验

表5 vWF基因19内含子MspI多态性与vWF表达水平的关系

表6 脑梗死组vWF基因19内含子MspI多态性与vWF表达水平的关系

表7 脑梗死的危险因素

两两比较结果显示病例组vWF基因19内含子MspI M＋／M－和M－／M－基因型血浆vWF表达水平比较差异显著有统计学意义（P＜0.01）；M＋／M＋和M＋／M－基因型、M＋／M＋和M－／M－基因型血浆vWF表达水平比较差异无统计学意义 （P＞0.05）（表6）。

2.6 影响急性缺血性脑梗死发生的危险因素将急性脑梗死的发生作因变量，以拟选定的，高血压病病史、vWF血浆含量和M－／M－作为自变量，采用非条件Logistic回归分析影响脑梗死的发生的危险因素。Logistic回归分析结果高血压病病史、vWF血浆含量 和M－／M－，3个变量与急性脑梗死的发生有关。并且偏回归系数均为正值，Exp（β）大于 1，说明高血压病病史、vWF血浆含量和M－／M－基因型是急性脑梗死发生的危险因素（表7）。

3 讨论

vWF是血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成的一种大分子糖蛋白。当内皮细胞受到损伤时，vWF能够从内皮细胞的韦伯一潘拉迪小体分泌到血浆或血管内皮下。通过血小板膜糖蛋白IB2X介导血小板与内皮下胶质的黏附，成为血小板与内皮下成分黏附的桥梁。内皮受损vWF大量释放入血，介导血小板黏附聚集于受损的血管内皮下启动凝血导致血栓形成［7－8］。血栓形成病理过程中，血管内皮细胞损伤，血小板活化起关键的作用。vWF是目前公认的内皮细胞标记物，仅在成熟的内皮细胞上存在，它可以反映内皮细胞的功能状态。血浆高水平的vWF常伴随着发生血栓形成疾病的危险，对高血压病人、冠心病、脑梗死的发病有预测价值［9－10］。Jansson等［11］研究表明在心肌梗塞幸存者中，vWF表达水平增高与再发梗塞或心源性死亡的危险性增加有关。本研究入组病例时排外心源性及外周血管病，选取大动脉硬化性脑梗塞。结果显示血浆vWF表达水平在急性脑梗死后24小时内明显升高，说明急性大动脉硬化性脑梗死患者此指标表达活跃，参与急性脑梗死的病理过程。进行Logistic多元回归分析，发现血浆vWF水平表达增高和高血压是急性缺血性脑梗死发生的危险因素，进一步证明vWF在脑梗死发生中起关键作用。vWF指标测定对大动脉硬化性脑梗死的早期诊断及治疗具有重要意义，为急性脑梗死患者早期溶栓及抗血小板治疗提供依据，对观察病情演变及判断预后均有重要的临床价值。

有资料显示vWF基因19内含子Mspl酶切位点多态性可能是冠心病的一个遗传标志，其M＋／M－基因型可能是引起冠心病包括心肌梗死和心绞痛的一个危险因素。提示M＋／M－基因型在冠心病的发生、发展中所发挥的作用可能与循环vWF水平有关［12］。Mercier［6］研究发现高加索人中，在vWF基因第19号外显子的3′端存在MspI的多态性位点。MspI＋／MspI－的频率为0.33∶0.67。李震宇等［5］研究发现在我国汉族人群，同样存在该位点的多态现象，但发生频率低于高加索人，在我国汉族人中 MspI＋／MspI－的频率为 0.20∶0.80；彝族人为0.26∶0.74、傣族人为0.17∶0.83。本研究结果M＋与M－等位基因的发生频率为0.264∶0.736；各等位基因型的分布与国内其它地区人群有一定差异，与白种人群差异较大。这种差异可能是由于地域和种族不同，环境与基因相互作用的结果，我国汉族人种与国外人种存在较大差异，中国人群高血压、脑梗死的发病率均高于西方人群，而血脂水平却普遍低于西方人群。云南省属于高海拔地区，昆明位于云南省中部平均海拔为1894米左右，地理环境较特殊。本研究vWF基因多态性分布的Hardy-Weinberg检验，病例组、对照组及总体人群的基因型分布的观察值和预期值差异无显著性 （P＞0.05），说明我们所选择的研究人群基因频率能够代表群体的基因分布。因此19内含子Mspl酶切位点多态性检验在vWF的基因诊断中有一定的价值。为进一步有效筛选脑梗死的候选基因，需要更多的大样本的临床研究和开展遗传流行病学、分子流行病学研究及综合考虑多因素，对基因－基因及基因－环境相互作用进行深入研究。

目前关于vWF基因19内含子MspI多态性与脑梗死的相关性研究的较少。本研究结果脑梗死组vWF基因19内含子MspI多态性基因型M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型的循环vWF表达 水平分别为 （170.00±78.67）%、（148.62±62.58）%和（205.38±92.68）%各基因型血浆vWF表达水平之间比较差异有统计学意义（P＜0.01），M－／M－型频率均高于对照组（P＜0.01）。Logistic回归分析证实MspⅠ酶切位点多态性M－／M－基因型是急性脑梗死发生的危险因素之一。vWF基因MspⅠ酶切位点多态性可能是通过升高vWF水平在急性脑梗死的发生中发挥作用。其究竟通过何种机制影响循环vWF水平，是在剪接水平上，抑或与其他基因多态性连锁，尚需进一步深入研究。

［1］ 潘剑罡，刘洲.急性脑梗死患者细胞粘附分子－1、P－选择素和von Willebrand因子含量变化及其临床意义研究［J］.神经疾病与精神卫生，2005，5（2）：92－93.

［2］ 高宝山，白新学，金点石，等.脑梗死患者血浆血管性血友病因子等三种因子的测定及其临床意义［J］.中国脑血管病杂志，2006，3（8）：365－368.

［3］ 王新德.各类脑血管病诊断要点［J］.中华神经科杂志，1996，29：379－380.

［4］Lacquemant C，Gaucher C，Delorme C，et al.Association between high von willebrand factor levels and the Thr789 Alav vWF gene polymorphism but not with nephropathy in type Idiabetes［J］.The GENEDIAB Study Group and the DESIR Study Group.Kidney Int，2000，57（4）：1437－43.

［5］ 李震宇，傅建新，万海英，等.中国汉族人群vWF基因 MspI和RspI限制性片段长度多态性研究［J］.中华血液学杂志，1998，19（3）：115－117.

［6］Mercier B，Gaucher C，Mazurier C.An MspⅠpolymorphism in the von Willebrand factor gene［J］.Nucle Acid Res，1990，18：7467.

［7］ 徐丙超，何明利.急性脑梗死患者治疗前后血浆HCY、vWF和血清P－选择素水平检测的临床意义［J］.中国医药导报，2010，7（6）：33－34.

［8］Cherian P，Hankey CJ，Eikelboom JW，et al.Enkothelial and platelet activation in acute ischemic stroke and its etiological suhtypes［J］.Stroke，2003，34（9）：2134－2137.

［9］Schoch HJ，Fischer S，Marti HH.Hypoxisinduced vascular leakage in the brain［J］.2002，125（Pt11）：2549－2557.

［10］Baker RI.Platelet glycoprotein Ibalpha Kozak polymorphism is associated with an increased risk of ischemic stroke［J］.Blood，2001，98（1）：36－40.

［11］Jansson JH，Nilsson TK，Johnson O.Von Willebrand factor in plasma： anovel risk factor for recurrent myocardial in farction and death［J］.Br Heart J，1991，66：351－355.

［12］吴士尧，殷兆芳.vWF基因19内含子Msp I多态性、循环水平与中国人冠心病关系的研究［J］.上海医学，2003，26（4）：230－232.

Relationship of vWF gene MspI polymorphism with acute cerebral infarction in Han Chinese in Kunming.

LIU Jiang，ZHAI Ming，ZHANG Lei，DONG Manli，ZHANG Qin，ZHAO Zhong.Department of Neurology，The first people’s Hospital of Yunnan province，Kunming 650032，China.No.157，JinBi Road，Kunming city.Tel：0871－3638677.

Objective To explore the correlation of vWF（von Willebrand factor）plasma levels and its gene intron 19 MspI（major surface protease I） restriction site polymorphism with the attack of acute acute cerebral infarction and to investigate allele distribution frequencies of the vWF gene intron 19 MspI restriction site in Han Chinese in Kunming.Methods One hundred nineteen patients with acute cerebral infarction（24 h）patients and 117 cases of healthy people in Han Chinese Kunming controls were recruited in the present study.Plasma vWF level were determined by immune turbidimetry and vWF gene MspI polymorphism in intron 19 was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism with MspI restriction enzyme digestion.Results Plasma vWF level（189.37%±89.55%）was significantly higher in acute cerebral infarction group than in control group（P＜0.05）.The M＋／M＋，M＋／M－and M－／M－genotype frequencies of vWF gene intron 19 and MspⅠrestriction sites were 0.047， 0.377 and 0.576 and M＋／M-allele frequencies were 0.235：0.765.MspⅠM－／M-genotype frequency was significantly higher in cerebral infarction group than in normal control group（P＜0.05）.In patient group，plasma vWF levels were 170.00%±78.67%in M＋／M＋， 148.62%±62.58%in M＋／M－and 205.38%±92.68%in M－／M－and the vWF levels were significantly different among those different genotypes（P＜0.05）.Conclusion Plasma vWF levels，MspⅠpolymorphism in intron 19 and M－／M-genotype are significantly correlated with acute cerebral infarction and the distribution of vWF gene intron 19 and the distribution of MspⅠM＋and M-allele in Han Chinese Kunming are different with other populations.

Acute cerebral Infarction von Willebrand Factor gene Polymorphism MspI restriction site

R743.3

A

2011－01－26）

（责任编辑：李 立）

* 云南省第一人民医院神经内科 （昆明650032）

（E-mail：zhaiming68＠126.com）