海人酸致痫大鼠中多药耐药相关蛋白1和主穹窿蛋白的表达及作用

王海燕,任艳霞,杜 宁

(1.佳木斯大学第一附属医院儿科,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学在读研究生,黑龙江佳木斯 154007)

癫痫是一种神经系统的常见病,但仍有1/3的患者对药物治疗无效而成为难治性癫痫(intractable epilepsy,IE,RE)。然而人们对IE的形成机制尚不清楚,耐药蛋白可能在其中发挥着重要的作用。多药耐药相关蛋白1(M RP1)和主穹窿蛋白(M VP)均是目前研究的热点,分别由MRP和LRP基因编码,两者均位于16号染色体上,MRP定位于16p13.1,LRP定位于16p11.2,相距大约27cM.本课题利用海人酸致痫大鼠模型,观察海马中M RP1和MVP的表达,以及两者之间是否有相关性,以探讨其与癫痫耐药性的关系及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康80只 Wistar大鼠,体重 250～300g,雌雄不限,由佳木斯大学动物实验中心提供,随机分为对照组24只、KA组28只、TMP治疗组28只,每个小组再分1d、3d、7d 3个时间点。

1.2 主要试剂

海人酸(美国Sigma公司),MRP1抗体、MVP抗体(北京博奥森生物工程有限公司),二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 海人酸癫痫模型建立及大鼠惊厥分级

将大鼠麻醉后固定于立体定位仪上,头颅正中切开皮肤,暴露前囟。在头架上,将进样器针尖抵住前囟位置读出X、Y、Z的原始值视为原点,参照大鼠脑立体定位图谱[1]所确定的目标即右侧海马CA3区:X-4.5mm,Y+4.5mm,Z硬膜下4mm,将微量进样器抽取KA1μ L(将KA用注射用水配制 10mg/5mL,即 2μ g/μ L),调整 XY 坐标 ,显露硬膜,再调整Z轴使进样器针头平稳深入至硬膜下4mm,半分钟内缓慢注入KA,留针3～5min,再缓慢提起进样器针尖。对照组以NS代替KA,余同模型组。癫痫发作按Racine[2]分级:Ⅰ级,面部肌肉痉挛表现为咀嚼运动;Ⅱ级,颈部肌肉痉挛表现为点头运动;Ⅲ级,一侧前肢阵挛;Ⅳ级,站立性伴双前肢阵挛;Ⅴ级,在Ⅳ级基础上身体向后倒下。

1.4 脑标本制备及免疫组化法检测M RP1和MVP的表达

用10%水合氯醛(360mg/kg)麻醉后,暴露心脏,迅速经左心室灌注NS及4%多聚甲醛,然后断头、取脑、固定、石蜡包埋,4μ m常规切片。做HE及免疫组化染色,操作按试剂盒说明书进行。每张切片对应部位抽取5个视野,计算平均阳性细胞数。

1.5 统计学处理

表1 不同处理组在不同时间海马M RP1和MVP阳性细胞数(± s)

表1 不同处理组在不同时间海马M RP1和MVP阳性细胞数(± s)

注:与对照组比较,*P＜0.01;KA组内各个时间点比较**P＜0.05。

时间(d) 平均M RP1阳性细胞数 平均MVP阳性细胞数对照组 KA组 对照组 KA组1 1.70±0.11 7.93±0.66** 1.18±0.03 1.48±0.20**3 0.28±0.02 14.28±0.09* 1.03±0.07 4.94±0.02*7 0 21.71±0.24* 0.93±0.15 11.22±0.78*

2 结果

2.1 大鼠癫痫诱发情况

KA组大鼠注射KA后约半小时即开始出现不同程度的癫痫发作,最初表现为眨眼、动须、动耳、咀嚼、对牙(I级)及节律性点头、翘尾(Ⅱ级);继之出现对侧前肢阵挛(Ⅲ级);混合出现双侧前肢阵挛(Ⅳ级);四肢抽搐、跌倒和失平衡(V级)。

2.2 各组大鼠M RP1和MVP免疫组化检测结果

与对照组比较,KA组的MRP1和M VP的表达明显增高(P＜0.01);KA组的M RP1和MVP随时间点逐渐升高,7d末达高峰,组内各时间点比较有显著性差异(P＜0.05);MRP1免疫阳性细胞主要位于海马CA3区其次为CA1区的血管内皮细胞及部分神经胶质细胞,MVP切片在皮质和海马中均可见到MVP阳性细胞,主要位于小胶质细胞,在微血管内皮细胞以及血管周围的星形胶质细胞中也有表达。见表1。

2.3 M RP1和MVP蛋白在KA模型海马组织中表达关系

在KA模型海马组织中M RP1和MVP的表达呈正相关(r=0.986,P＜0.01)。

3 讨论

最近M RP1和MVP与癫痫耐药的关系引起了国内外学者的兴趣,各家报道不一,目前正处于探索阶段。尤其这两种蛋白在同一组织表达的比较研究还很少见到。本实验通过研究MRP1和MVP是否在IE模型中出现异常表达,及其表达上的关系,以此探讨在IE的发病机制中可能的作用。MRP1属于 ATP结合盒转运蛋白超家族,是依赖于ATP的药物外排泵。同时M RP1是谷胱甘肽-S-共轭物转运泵,转运共轭的阴离子,可能包含两个结合位点,允许与药物-GSH复合物的直接结合,或者与GSH及底物相继结合。有人提出,其中一个结合位点与GSH亲和力较低;另一个正好相反。所以存在两种转运机制:带阴离子的底物被直接转运;带阳离子或中性电荷的分子必须借助于GSH,即共运输途径。MRP1不但定位于细胞膜,而且存在于内质网、高尔基滤泡处,提示M RP1还可在细胞内隔离药物,使药物不能与靶位点结合,从而间接导致耐药。M VP是穹窿体的主要组成部分,它能与进入细胞质中的药物形成囊泡,并通过胞吐作用排出细胞,致靶点药物有效浓度降低而产生耐药。其耐药可能机制有两种:(1)阻止以细胞核为靶点的药物进入细胞核,即LRP具有中间塞子的作用,阻止药物进人细胞核内,或者把已经进人核内的药物通过转运载体再重新运到细胞核外。(2)将细胞浆中的药物转运至运输囊泡,从而使药物呈房室性分布,并通过胞吐机制将其排到细胞外,降低细胞内的药物浓度,最终产生耐药。本实验结果显示:M RPI对照组大鼠海马内仅有少量阳性细胞,主要为神经元和神经胶质细胞。KA组大鼠海马内MRPI阳性细胞显著增多,MVP在对照组中有弱表达,KA组较对照组明显增高,且主要表达在小胶质细胞中。MVP在难治性颞叶性癫痫患者脑组织中的血管内皮细胞中广泛表达,在其病变部位的神经元MVP表达上调。关于MRP1和MVP的表达部位尚无定论,人类和大鼠中表达部位的差异是否有种属差异引起尚无相关实验证明。本研究还发现KA组内MRP1和MVP的表达均比对照组明显增高,长病程组MRP1和M VP表达较短病程组显著增强,短病程组表达较对照组显著增强,提示M RP1和M VP在IE早期形成中起作用,在后期并近一步增强;并指出这5种蛋白共同参与了IE的耐药性[3]。有实验证明,M RP1和MVP的过度表达与耐药程度呈正相关,且二者表达有相似之处,并且本实验统计学上亦证明二者有显著的相关性;但亦有言论说虽然二者基因定位于16号染色体短臂上,位距27cm,估计二者有某种相关性,但两者极少同时扩增,故二者在难治性癫痫中的表达是否相关如何相关还需要进一步研究。

[1]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,1991,35

[2]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation[J].Elec troencephalogr Clin Neuro-physiol,1972,32:281-294

[3]肖争,王学峰,晏勇,等.难治性癫患者脑组织中 5种耐药基因产物的同步表达及临床意义[J].中华神经科杂志,2004,37(6):500-503