何首乌对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的作用

朱秋双,任春清,包利泽,赵锦程,刘 蕾,白 雪,杨 玉

(1.佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯 154007;2.佳木斯市中心医院,黑龙江 佳木斯154002;3.佳木斯中小学保健所,黑龙江 佳木斯154002)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又称原发性痴呆症是一种与年龄高度相关的、以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。该病以潜隐性起病、痴呆缓慢进行性加重为特征,临床表现为记忆力、判断力、抽象思维等一般智力的丧失,神经病理改变可见神经元变性、丢失引起的脑萎缩,细胞外的老年斑(senile plaque,SP)等。本病要经历两种死亡,首先是精神死亡,然后是肉体死亡,给患者本人、家庭和社会带来相当沉重的负担。何首乌为蓼科植物的块根,具有补肝益肾,益髓延年之功,为传统的益智药。有报道何首乌对小鼠学习记忆功能有促进作用。本研究旨在进一步观察何首乌对Aβ1-40致AD小鼠的学习记忆能力的改善作用并探讨其机理。

1 材料与方法

1.1 实验药物

Aβ1-40(美国Sigma公司),1:1何首乌硫浸膏(黑龙江省药材公司提供并由佳木斯大学药理教研室加工)。

1.2 实验仪器

Y-迷宫:北京微信斯达科技发展有限责任公司生产。

1.3 动物

SD雄性大鼠,体重约200～220g,佳木斯大学实验动物中心提供,动物合格证黑动字第99101001号。

1.4 实验方法

1.4.1 动物筛选与分组

大鼠适应环境1d后,先将大鼠放入Y型电迷宫中,适应5min,使其对3臂均探索进入,然后从I臂开始随机次序变换测试,给电压30～70V,电流0.5～0.7mA,延迟时间 5s。电击后大鼠逃避至安全区为正确反应,否则为错误反应。每测1次休息30s,测10次休息5min。大鼠学习记忆成绩以连续10次测试中有9次(9/10)正确反应时,所需电击数表示。测试在上午进行,连续30次未跑正确者被淘汰。再将动物随机分成3组:对照组,阿尔茨海默病模型组及何首乌硫浸膏治疗组,每组10只。

1.4.2 Aβ孵育

用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成10μ g/μ L,37℃下孵育1周,使其变为聚集状的Aβ1-40。

1.4.3 动物模型的制作[1]

大鼠腹腔注射浓度100g/L水合氯醛(0.35g/kg)麻醉动物,然后固定于脑立体定位仪上,分开筋膜于前囟后3.0mm,中线右侧2.0mm处钻开颅骨,切开硬脑膜后,自脑表面缓慢垂自进针2.9mm(控制注射速度 0.2μ L/min),阿尔茨海默病模型组注射聚集状 Aβ1-40 1μ L,留针 5min,然后缓慢撤针。对照组只注射等量生理盐水,余操作同上。

1.4.4 分组给药

大鼠醒后,何首乌组即何首乌硫浸膏25g/(kg◦d)灌胃,每日分两次(上午9时和下午4时)。其余组均灌等量的生理盐水。

1.4.5 大鼠分辨学习能力的检测

各组在同时间点(术后 5、10、15、20d)按前述说明进行Y迷宫测试,规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为“正确反应”,以达到连续9次电击为正确反应,所需的电击次数表示其学习获得能力。若次数超过30次则不再测试,并以30次为最大值计数。

1.4.6 记忆保持的观察

用Y-迷宫检测上述小鼠在达到分辨学习的学会标准后24h记忆的保持,连续检测10次记录,其中正确反应次数,以记忆保持的百分数表示。

1.4.7 形态学观察[2]

在行为学检测结束后,将大鼠拉断颈椎处死,迅速取出全脑,10%福尔马林溶液中固定72h,常规包埋石蜡切片,冠状连续切片(厚度50μ m),海马组织每 5张取1张,一个标本取3张,HE染色×540光学显微镜下观察大鼠海马CA1区细胞形态。细胞计量采用每 200μ m×400μ m长度下正常细胞数,每张切片观察一个计量单位,取平均值为该标本的细胞记数。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠学习记忆能力测试结果

结果表明术前各组学习能力基本一致。原发性痴呆症模型组大鼠主动逃避电击次数明显多于两个对照组,且随时间推移,所需电击次数反而增加,说明该组大鼠学习记忆获得能力明显下降。治疗组在术后5d,10d与模型组无明显差异(P＞0.05),但在15d后与模型组比较(△P＜0.05),且至术后20d时学习记忆获得能力有明显提高,与模型组比较(＊P＜0.01),与对照组比较(▲P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠迷宫学习能力的结果(n=10,± s,次)

表1 各组大鼠迷宫学习能力的结果(n=10,± s,次)

注:与对照组比较▲P ＜0.05,;与模型组比较△P＜0.05,＊P＜0.01。

组别 术前 术后5d 术后10d 术后15d 术后20d原发性痴呆症模型组 13.1±2.1 25.4±5.6 26.7±6.1 26.6±6.1 27.5±5.3何首乌硫浸膏治疗组 14.6±2.3 24.4±6.2 20.9±5.4 18.4±4.6△ 15.3±2.8＊▲_正常对照组___________________________________________________________________________________________________________________________________14.3±2.8_13.2±2.9_11.3±2.0_13.8±1.8_10.4±1.3

2.2 记忆保持的观察和海马细胞数

结果表明与正常对照组比较,原发性痴呆症模型组和何首乌硫浸膏治疗组记忆能力均降低,海马细胞数均减少,差异有统计学意义。与原发性痴呆症模型组比较,何首乌硫浸膏治疗组记忆能力提高,海马细胞数提高,差异有统计学意义(△P ＜0.01),见表2。

表2 对大鼠学习与记忆能力及海马正常细胞数的影响(n=10,± s)

表2 对大鼠学习与记忆能力及海马正常细胞数的影响(n=10,± s)

注:与对照组比较＊P＜0.01,▲P＜0.05;与原发性痴呆症模型组比较△P＜0.01。

组别 记忆能力(正确%) 海马细胞数原发性痴呆症模型组 47.49±2.99＊ 74.49±2.62＊何首乌硫浸膏治疗组 65.56±3.33▲△ 83.53±3.91＊△正常对照组 69.22±3.98 98.12±2.69

3 讨论

原发性痴呆是指在老年人衰老退化基础上发生的痴呆,如早老性痴呆、老年性痴呆等。原发性痴呆的病因及发病机制目前尚不十分清楚。有研究认为是39-43个氨基酸组成的Aβ沉积为特征的进行性中枢神经系统变性疾病,还证明Aβ的营养作用和毒性作用取决于它从可溶性表明变为不可溶性的聚集状态。目前认为神经毒性物质Aβ在脑中广泛沉积在原发性痴呆发病中起中心作用,能引发神经元退化和凋亡等诸多病理过程,最后引起痴呆。由于海马与学习记忆,特别是近记忆功能密切相关,是原发性痴呆中最易受累的脑区之一[3]。因此本研究利用立体定向技术将聚集态Aβ注入大鼠右侧海马,用Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力,观察到大鼠的学习记忆能力明显下降,海马细胞数减少,阿尔茨海默病模型制作成功。何首乌具有补肝肾,益精血,乌须发,强筋骨,延缓衰老功效。大鼠何首乌硫浸膏25g/(kg◦d)灌胃,观察到何首乌对阿尔茨海默病模型大鼠的分辨学习及记忆保持能力有极大提高,对海马细胞数有保护作用。因此通过本实验可得出结论何首乌对大鼠的学习记忆有保护作用,其具体机制可能与其抑制海马细胞凋亡有关。

[1]鄢嘉,曾超,吴云霞,等.续断总皂苷对阿尔茨海默病小鼠_学习记忆能力的改善作用[J].武汉大学学报,2010,31(3):324-325

[2]朱秋双,刘明远,刘蕾,等.青风藤对吗啡成瘾小鼠学习与记忆能力的影响[J].黑龙江医药科学,2009,32(4):9-10

[3]Giovannel L,Gasamenti F,Scall C,et al.Differential effect of amyloid peptide Aβ1-40 injection into the rat nucleus basalis[J].Neuroscience,1995,66:781-782