纳米细菌致兔胆囊结石的研究

刘亚楠 张国彬 马立人

(河北联合大学基础医学院免疫学教研室 河北唐山 063000)

1989年，芬兰科学家Kajander发现了一种能通过100nm滤菌器的微生物并于1990年申请了专利，其命名这种微生物为纳米细菌(Nanobacteria Nb)[1]。目前，随着对纳米细菌及其致病性的研究不断深入，已发现纳米细菌与多种病理性钙化疾病如肾结石、动脉粥样硬化、前列腺结石等的发生发展密切相关。本研究通过建立纳米细菌致兔胆结石动物模型并将从兔胆汁培养出的纳米细菌再次感染实验兔，致使兔胆囊结石再次发生。验证了纳米细菌符合科赫氏法则具有感染性并再次证实了纳米细菌感染与胆结石的形成有关。

1 资料与方法

1.1 一般资料 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(许可证编号:SCXK京2005－0002)雄性日本大耳白兔共计96只，月龄4个月，清洁级;所有日本大耳白兔在华北煤炭医学院动物实验中心屏障环境下饲养，室温22～23℃，单笼饲养，昼/夜各12小时交替，光照不足时以日光灯代替。实验之前，所有动物均适应性饲养1周。

1.2 主要试剂 酶标记免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒:芬兰Nanobac OY公司;医用吻合剂:中国广州医用胶有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胆汁纳米细菌的培养与鉴定。胆汁纳米细菌的培养与鉴定的方法参照[2]。

1.3.2 实验干预前采集所有日本大耳白兔耳静脉血5mL，分离血清并用ELISA检测(按照试剂盒说明书操作)，排除纳米细菌抗体阳性实验日本大耳白兔。

1.3.3 实验分组。①胆石症患者胆汁纳米细菌感染性实验。实验日本大耳白兔48只随机分成3组:患者胆汁Nb感染组16只;DMEM全培养液(一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养液)空白对照组16只;Hap对照组16只。②日本大耳白兔胆汁纳米细菌感染性实验。实验日本大耳白兔48只随机分成3组，日本大耳白兔胆汁Nb感染组16只;DMEM全培养液空白对照组16只;灭活的Nb对照组16只。

1.3.4 胆囊内注射用纳米细菌悬液的制备。从胆汁(患者，日本大耳白兔)中培养得到的纳米细菌进行第2次传代，然后继续培养4周后，取出培养瓶，旋紧瓶口螺纹盖，置于超声清洗仪器中，超声处理10分钟，使贴附在培养瓶壁的纳米细菌脱落，并使聚集成团的纳米细菌分散、混匀。应用浊度法测量纳米细菌培养液浊度，将浊度调整到355NTU的悬液，用1mL无菌注射器抽上述悬液0.3mL，共留取16只注射器，将盛有纳米细菌注射液的注射器至无菌容器内，送动物中心备用。

纳米级羟基磷灰石悬液(Hap悬液)的制备:模拟人体细胞外液环境下合成的羟基磷灰石，在37℃、5%CO2的细胞培养条件下持续孵育4周，然后按照纳米细菌悬液的制备方法制成羟基磷灰石悬液，用1mL无菌注射器抽上述混悬液0.3mL，共留取8只注射器，将注射器至一无菌容器内，送动物中心备用。

注射用DMEM全培养液的制备:纳米细菌培养时所使用的含10%γ射线照射过的胎牛血清(γ－FBS)和1%4－羟2基哌嗪乙磺酸;N－(2－羟乙基)哌嗪－N’－2－乙烷磺酸(HEPES)缓冲液的高糖DMEM培养液，在37℃和5%CO2的细胞培养条件下孵育4周。倒置显微镜下观察无纳米细菌生长。用1mL无菌注射器抽上述DMEM全培养液0.3mL，共留取16只注射器(两次实验分别为16只)，将注射器至一无菌容器内，送动物中心备用。

干烤灭活纳米细菌悬液的制备:180℃干烤4小时灭活的纳米细菌在37℃、5%CO2的细胞培养条件下持续孵育4周，倒置显微镜下观察纳米细菌未见生长。按照纳米细菌悬液的制备方法制成灭活组纳米细菌悬液，用1mL无菌注射器抽上述悬液0.3mL，共留取8只注射器，将注射器至一无菌容器内，送动物中心备用。

1.3.5 动物感染。将动物麻醉后，于右肋缘下开腹，肝下寻找胆囊，抽出胆囊胆汁，注入实验用悬液，生物胶封闭胆囊壁穿刺孔，关腹，肌肉注射青霉素3天(40万单位/次/日)，单笼饲养3周，耳缘静脉采血5mL后麻醉处死。抽取胆汁后剖开胆囊观察成石情况并收集胆结石。见图1。

图1 剖开胆囊观察成石

图2 纳米细菌培养结果

图3 纳米细菌间接免疫荧光

2 结果

2.1 胆汁纳米细菌培养 6份的胆汁标本纳米细菌培养均为阳性，培养至第4周镜下可见多数细菌集落贴附于培养瓶底部，见图2。镜下观察阴性对照培养液，未见纳米细菌生长。

2.2 胆汁纳米细菌的鉴定 细菌与8D10抗体产生特异性结合，图3中可见发出绿色荧光的纳米细菌。阴性对照未观察到绿色荧光。见图3。

2.3 实验动物的一般情况 在实验过程中，所有动物饮食饮水良好，无厌食表现，无疾病发生及意外死亡，胆石症患者胆汁纳米细菌感染性实验开始时日本大耳白兔平均体重为(2.13±0.31)kg，各组间实验日本大耳白兔体重比较无统计学意义。实验结束时日本大耳白兔平均体重约(2.27±0.42)kg，实验前后各组日本大耳白兔体重改变无统计学意义。日本大耳白兔胆汁纳米细菌感染性实验开始时实验日本大耳白兔平均体重为(2.08±0.65)kg，各组间实验日本大耳白兔体重比较无统计学意义，实验结束时日本大耳白兔平均体重约为(2.10±0.68)kg，实验前后各组日本大耳白兔体重改变无统计学意义。两次实验前后日本大耳白兔平均体重比较均无统计学意义。

2.4 ELISA检测结果 两次动物感染性实验干预前动物血清检测结果均为阴性。

2.5 成石率比较 胆石症患者胆汁纳米细菌感染性实验中患者胆汁纳米细菌培养物感染组胆结石发生率明显高于DMEM空白对照组和羟基磷灰石对照组，见表1。日本大耳白兔胆汁纳米细菌感染性实验中日本大耳白兔胆汁纳米细菌培养物感染组胆结石发生率明显高于DMEM空白对照组和灭活纳米细菌对照组，见表2。两次实验感染组成石率差异无统计学意义。

表1 胆石症患者胆汁纳米细菌感染性实验中各组胆结石发生率的比较(例)

表2 日本大耳白兔胆汁纳米细菌感染性实验中各组胆结石发生率的比较(例)

3 讨论

有文献报道，纳米细菌广泛存在于自然界的矿物质中和生物体内，能感染人类、牛、鹿和其它哺乳动物，是一种人畜共患的致病原[2]。1999年，Ciftcioglu对72例来自芬兰的肾结石标本进行纳米细菌培养和单克隆抗体免疫荧光染色鉴定，有70例呈阳性，表明97.12%的肾结石中含有纳米细菌[3]。

王利民等人将培养的纳米细菌注射到日本大耳白兔的胆囊内，2周后诱发出了胆囊黑色素结石[4]，我们采用类似的方法对感染组日本大耳白兔进行感染[5]。为了防止所用的实验日本大耳白兔已被纳米细菌感染，对实验结果造成影响，我们对刚购买的实验日本大耳白兔于耳缘静脉进行了采血，分离血清后进行了ELISA检测，检测结果均为阴性，可以认为实验日本大耳白兔未被纳米细菌感染，能够用于本研究，这与对注射悬液干预前所抽取的胆汁进行了纳米细菌培养均为阴性结果相符。

为明确胆结石患者胆汁纳米细菌感染对实验日本大耳白兔的致石作用，我们设立DMEM全培养液代替纳米细菌注射作为实验对照。由于纳米细菌能在不利于生长的情况下，利用环境中的钙、磷合成主要由羟基磷灰石构成的细菌被膜(biofilm)，来抵御不良环境的侵袭。体外研究表明:磷酸钙有促进胆石形成的作用[6]，因此我们用无机法合成的纳米级羟基磷灰石悬液代替纳米细菌悬液，注入日本大耳白兔胆囊内作为对照，观察纳米级羟基磷灰石对实验日本大耳白兔的成石作用。实验结果证明:单纯胆汁纳米细菌感染确实能导致日本大耳白兔胆囊结石的发生。而羟基磷灰石对照组16只实验日本大耳白兔中，也仅有3只发生胆囊结石，结石发生率为18.75%，与感染组比较，两组差异显著(P＜0.01)。为了避免注射物的量效差异引起实验结果偏差，我们注射纳米细菌悬液及羟基磷灰石悬液浊度均为355NTU，相当于浓度为107/mL，并且注入剂量均为0.3mL。这一结果表明:虽然羟基磷灰石作为一种促成核因子，在体外实验中有促进胆石形成的作用，但是由于正常机体的胆囊中存在抑成核因子，例如钙结合蛋白等即可抑制了羟基磷灰石在正常日本大耳白兔胆囊内的促成石作用，从而使羟基磷灰石组的实验日本大耳白兔并没有出现有统计学意义的胆囊结石。而纳米细菌被骤然从营养丰富、适于生长的环境中，移入含有高浓度的胆汁酸盐、磷脂、胆固醇及抗体(如SIgA)等不利的胆汁环境中时，则开始迅速利用胆汁中的钙、磷成分合成羟基磷灰石外壳，并与其它正在矿化的纳米细菌聚集成团，使之不断成长增大，破坏胆囊胆汁凝胶体系的动态平衡，使胆固醇、胆红素钙盐等成分析出，并为其进一步沉积提供始动的核心，进而导致胆囊结石的形成。另外，对照组总共32只实验日本大耳白兔中有4只日本大耳白兔在手术之后3周时发生了胆囊结石，而ELISA检测结果均为阴性，说明对照组实验日本大耳白兔并未被纳米细菌感染，考虑手术本身对日本大耳白兔胆囊内胆汁的胶体平衡体系也可能造成一定影响，可能是实验日本大耳白兔手术后形成胆囊结石的一个诱因。

为了进一步验证纳米细菌具有感染性，我们设立了日本大耳白兔胆汁纳米细菌感染性实验，感染组共16日本大耳白兔，手术注射纳米细菌3周后，9只产生胆囊结石，结石发生率为56.25%，而DMEM对照组16只日本大耳白兔中有1只发生胆囊结石，结石发生率为6.25%，统计学分析显示，两组差异显著(P＜0.01)，这与第一次动物实验结果相符。16只注射干烤灭活的纳米细菌悬液的对照组中有2只发生胆囊结石，结石发生率为12.50%，与感染组比较，两组差异显著(P＜0.01)，这说明经过高温干烤过的纳米细菌处于失活状态，其致病性消失，不能再利用钙、磷成分合成羟基磷灰石外壳及聚集成团，丧失了致结石能力。无论是羟基磷灰石还是干烤灭活的纳米细菌其成石率都远远低于有活性的纳米细菌，这从侧面证明纳米细菌作为一种生物存在于自然界。另外，我们对胆结石患者胆汁纳米细菌培养物感染组与日本大耳白兔胆汁纳米细菌培养物感染组结石发生率进行了比较(P＞0.05)，差异无统计学意义，说明无论是人胆汁培养出的纳米细菌还是日本大耳白兔胆汁培养出的纳米细菌都具有促进胆结石形成的作用，但日本大耳白兔胆汁纳米细菌培养物感染组成石数量比胆结石患者胆汁纳米细菌培养物感染组少4个，可能是因为纳米细菌经传代培养后其致病性减弱的缘故。

[1]Kajander EO.Culture and detection method for sterilefilterable autonomously replicating biological particles[J].US patent，1992，5:135，851

[2]Barr SC，Linke RA，Janssen D，et al.Detection of biofilmformation and nanobacteria under long－term cell culture conditions in serum samples of cattle，goats ，cats ，and dogs[J].AmJ Vet Res，2003，64(2):176

[3]Ciftcioglu N，Bjorklund M，Kuorikoski K，et al.Nanobacteria:an infectious cause for kidney stone formation[J].Kidney Int，1999，56:1893

[4]Wang L，Shen W，Wen J，et al.An animal model of black pigment gallstones caused by nanobacteria[J].Dig Dis Sci，2006，51(6):1126

[5]刘亚楠，王兴伟，马立人.胆汁纳米细菌培养及鉴定[J].华北煤炭医学院学报，2011，13(3):312

[6]Vanden Berg AA，Van Buul JD，Tytgat GN，et al.Mucins and calcium phosphate precipitates additively stimulate cholesterol crystallization[J].J Lipid Res，1998，39(9):1744