大花重瓣非洲紫罗兰植株再生过程中内源激素变化规律的研究

王海霞 ,韩 雪,纪丽丽,刘海燕

(黑龙江林业职业技术学院,黑龙江牡丹江157011)

1 引言

非洲紫罗兰Saintpau lia ionantha,为苦苣苔科多年生草本,是世界著名小盆花之一。因花期长、较耐阴、株形矮小雅致,花小艳丽,被誉为“室内花卉皇后”,极具市场开发前景。目前非洲紫罗兰品种组织培养技术已经取得了一定的进展[1～3],但已有的非洲紫罗兰组织培养技术并不适用于新培育的大花、重瓣型品种,表现在培养周期长、芽诱导再生数量少、品种退化严重等问题上。

植株生长发育过程与植株内源和外源激素的种类、浓度配比有密切关系[4]。Fosket认为,各种愈伤组织分化时,对外源激素的要求不同,主要是受内源激素的影响[5],而目前对大花重瓣非洲紫罗兰再生过程中内源激素的研究尚未见报道。本文研究大花重瓣非洲紫罗兰再生过程中内源激素的变化规律,为合理添加外源激素,提高愈伤组织的分化率提供了理论依据。

2 材料与方法

2.1 选用材料

非洲紫罗兰紫色品种取自香港紫罗兰有限公司。以非洲紫罗兰叶片为外植体。经75%乙醇漂洗30～60s,0.1%升汞浸泡搅拌10min,无菌水冲洗3遍。

2.2 培养基

选用MS为基本培养基,用于固化的琼脂均为8g◦L-1。培养基使用前,先将 pH 值调至6.0,然后用300m L的广口瓶分装,每瓶30m L,封口膜包扎,在121℃,灭菌20m in。接种后放置在恒温培养室中培养,温度为(25±2)℃,光照强度为1 000～2 000lx,每天光照12h。

2.3 愈伤组织的诱导

外植体消毒后,将叶片剪成1.0cm2左右的小块,叶面向上接种于 M S+6-BA 1.0m g/L+NAA 0.5mg/L的培养基上。先进行2周的暗培养,然后再移至光下培养。

2.4 不定芽再生

愈伤组织诱导约30d后,继代培养2次,选取色泽鲜艳、浅绿色或黄绿色、质地紧密、表面呈颗粒状突起愈伤组织,转移到分化培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L上。

2.5 取样与激素提取

样品每隔5d随机取样一次,每次称重0.5g,置于-40℃冰箱中保存。取样品,加2m L样品提取液,在冰浴下研磨成匀浆,转入10m L试管,再用2m L提取液分次将研钵冲洗干净,一并转入试管中,摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取 4h,5 000r/min离心10min,取上清液。上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤为80%甲醇(1m L)平衡柱→上样→收集样品 →移开样品后用100%甲醇(5m L)洗柱→100%乙醚(5m L)洗柱→100%甲醇(5m L)洗柱→循环。将过柱后的样品转入5m L塑料离心管中,真空浓缩干燥或用氮气吹干,除去提取液中的甲醇,用1.0m L样品稀释液定容。

2.6 内源激素的酶联免疫测定

在10m L包被缓冲液中加入一定量的包被抗原,混匀,在酶标板每孔中加 100μL,37℃下温育3h。洗板3次,甩干。分别加入脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)4种标准物,再加入待测样和抗体,37℃竞争0.5h。洗板5次,甩干。然后加酶标羊抗兔抗体,37℃反应30m in。洗板5次后加底物显色,显色适当时加入2mo l/L硫酸终止反应。用2 000ng/m L浓度孔(即标准曲线最高浓度孔)调0,在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品492nm处的OD值[6]。

2.7 统计方法

所得数据采用Excel计算机软件进行相关性分析。

3 实验结果与分析

3.1 大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织诱导过程中生长变化情况

接种10d后,部分分化培养基上的叶片从切口处开始膨大,20d后,叶片表面出现褶皱,30d切口处产生少量黄绿色愈伤组织,40d后愈伤组织黄绿色特征明显,并伴有绿色小芽点出现。通过对不同时期愈伤组织进行称质量发现,35d时愈伤组织增长率急剧上升,达到峰值,后期逐渐下降。

3.2 大花重瓣非洲紫罗兰分化过程中生长变化情况

切取诱导40d时的愈伤组织接种到分化培养基上,7d时愈伤组织表面长出黄色瘤状突起,14d时部分愈伤组织有绿芽或绿色突起发生,20d时约80%的愈伤组织分化出芽,以后为芽的伸长生长期,30d时个别绿芽可长到2cm左右,但是大部分玻璃化。

3.3 大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织诱导时期内源激素含量变化

如图1所示,愈伤组织诱导过程中,各激素含量变化较大。其中GA在愈伤组织诱导初期含量急剧下降,中后期基本维持不变,可见大花重瓣非洲紫罗兰发芽时GA的需求量较大,而在愈伤组织诱导过程中相对降低。ABA和ZR含量在诱导初期明显下降,中期也一直保持很低的水平,由此推测ABA和ZR是大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织诱导的负调控因子,其含量的下降有利于愈伤组织的发生。IAA含量在诱导起始阶段急剧上升,后又明显降低,说明IAA的强烈合成有利于愈伤组织的诱导,但是一旦愈伤组织发生,其需求量也随之降低。

图1 愈伤组织诱导时期内源激素含量变化

3.4 大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织继代过程中内源激素含量变化

如图2所示,愈伤组织继代过程中,ABA含量低于其它3种内源激素的水平,基本维持在愈伤组织诱导后期的水平。其中ZR在继代5d时处于峰值,原因是刚转移到新鲜培养基上,丰富的营养及调节剂促进了细胞分裂所致。后期ZR含量有所下降,GA含量明显升高,与试验中观察到的小部分愈伤组织分化出芽有关。IAA在继代初期含量明显上升,说明在此阶段IAA的合成有利于愈伤组织的大量形成。

图2 继代培养过程中内源激素含量变化

3.5 大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织分化过程中内源激素含量变化

如图3所示,愈伤组织分化过程中,ABA的含量基本保持一个较低的水平,其含量对愈伤组织的分化影响不大,IAA和ZR在愈伤组织分化初期含量均处于上升趋势,分化10d后,其含量明显下降,分析原因IAA和ZR是分化过程中的负调控因子。GA含量一直呈上升趋势,尤其在分化前期和绿芽伸长期含量上升幅度较大,明显高于继代培养过程中的水平,说明GA对大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织分化有重要作用。在此过程中添加适当浓度的外源GA能否提高大花重瓣非洲紫罗兰愈伤组织的分化率,还有待于进一步研究。

图3 分化过程中内源激素含量变化

4 结语

植物生长调节剂是植物组织培养器官分化的关键因素,调节其水平和配比已成为提高组织分化频率的有效手段,而不定芽再生率的高低因所用植物生长调节剂的种类、浓度及组合而异[7]。结果表明：大花重瓣非洲紫罗兰在植株再生过程中不同阶段内源激素的变化规律各不相同。适当添加IAA有利于愈伤组织的形成;GA在愈伤组织继代和分化过程中都呈现上升的趋势,因此,可以适当提高GA的添加量;而ABA在愈伤组织诱导过程中含量下降,在继代和分化过程中的含量基本处于一个较低的水平,是负调控因子。

[1]何家涛.非洲紫罗兰组培技术研究[J].天津农业科学,2006,12(1)：20～ 22.

[2]曹秀敏,刘宏敏.非洲紫罗兰的组织培养和植株再生[J].河南大学学报,2005,6(2)：61～62.

[3]黄 靖.非洲紫罗兰组培快繁技术[J].福建农业科技,2007(5)：82～84.

[4]肖关丽,杨清辉.植物组织培养过程中内源激素研究进展[J].云南农业大学学报,2001(16)：136～138.

[5]夏时云,麦瑜玲.红掌叶片离体培养过程中内源激素含量的变化[J].华北农学报,2006,21(3)：16～ 18.

[6]唐尚格,夏玉先.间接酶联免疫法测定植物内源激素[J].西南农业大学学报,1991,13(2)：183～186.

[7]李 慧,陈晓阳.银白杨叶片不定芽再生影响因素的研究[J].北京林业大学学报,2004,26(3)：46～50.