食管鳞癌患者外周血Th17细胞的检测及意义

胡 琴，陈德玉

(1江苏大学临床医学院，江苏镇江212001;2江苏大学附属医院)

Th17细胞以表达IL-17而得名，是不同于Th1、Th2细胞的C D4+T细胞的新亚群，已经被证实参与机体的免疫应答、炎症反应、自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的发生、发展［1～3］。近年来的一些研究发现，Th17细胞在炎症相关性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，多种肿瘤患者机体内外周血及(或)肿瘤局部存在Th17细胞比例增高。本研究检测食管鳞癌患者外周血Th17细胞的比例变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2010年4月18日～2010年7月31日江苏大学附属医院胸外科33例食管鳞癌患者的外周血标本，其中男20例、女13例，年龄46～73岁、平均60.3岁。肿瘤位于食管上段者7例，中段者15例，下段者11例;肿瘤直径＞3cm者21例，≤3cm者12例;高、中分化23例，低分化及以下10例;TNM分期(2009 UICC)Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期3例。上述患者均有明确的病理诊断，且之前未接受过放、化疗等抗肿瘤治疗，均无传染性疾病、自身免疫性疾病等病史及免疫治疗史，且近期无感染性疾病等。18例健康志愿者外周血标本由江苏大学附属医院体检中心提供，其中男11例、女7例，年龄45～70岁、平均58.9岁，均无传染性疾病、自身免疫性疾病等病史及免疫治疗史，且近期无感染性疾病史等。本实验分3组:健康对照组及食管鳞癌(Ⅰ+Ⅱ)和(Ⅲ+Ⅳ)组。

1.2 主要试剂与仪器 荧光抗体鼠抗人CD4-APC、IL-17-PE购自eBioscience公司;佛波酯(PMA)、离子霉素(Ion)购自BD公司;莫能霉素购自Enzo公司;固定与透膜试剂盒(FIX/PERM)购自CALTAG公司;淋巴细胞分离液(Ficoll)购自天津灏洋试剂厂;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)购自 Gibco公司;FACS Calibur流式细胞分析仪为BD公司产品。

1.3 实验方法 在无菌条件下以EDTA抗凝管抽取研究对象外周静脉血6 ml。Ficoll密度梯度离心法常规分离外周血单个核细胞。以含10%FBS的1640培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×106/ml。加入刺激剂 PMA(50 ng/ml)、Ion(1 μg/ml)及阻断剂莫能霉素(2 μl)，予37℃、5%CO2条件下培养5 h。取细胞悬液 100 μl，加入 10 μl APC 标记的抗人CD4抗体，孵育30min后洗涤3次。加入100 μl固定剂A，反应15min后洗涤1次，再加入100 μl透膜剂B，反应5min后加入10 μl PE标记的抗人IL-17抗体，孵育30min后洗涤3次，以300 μl冷 PBS重悬细胞。24 h内采用流式细胞术检测分析。流式细胞仪检测以CD4设门，分析门内CD4+IL-17+细胞亚群，用 Cellquest软件分析 CD4+IL-17+细胞占CD4+细胞的比例。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测结果 食管鳞癌患者外周血Th17细胞占CD4+T细胞的比例为(6.3±3.5)%，显著高于健康对照组(1.8±1.2)%(P＜0.01)。食管鳞癌(Ⅰ+Ⅱ)期组外周血Th17细胞占CD4+T细胞的比例为(3.4±1.1)%，较健康对照组上调(P＜0.05);食管鳞癌(Ⅲ+Ⅳ)期组为(8.4±3.9)%，显著高于健康对照组(P＜0.01);食管鳞癌(Ⅲ+Ⅳ)期组Th17细胞比例显著高于(Ⅰ+Ⅱ)期组(P＜0.01)。

2.2 Th17细胞比例与临床病理特征的关系 Th17细胞比例与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度无明显相关，而与淋巴结转移和TNM分期相关(P均＜0.01)。

3 讨论

我国处于世界食管癌相对高发地带，其发病和死亡平均水平列恶性肿瘤前列［4］。越来越多的证据表明，包括食管鳞癌在内的许多肿瘤的发生、发展都与炎症联系密切。IL-17作为Th17细胞的标志性细胞因子，具有强烈的促炎症作用。Zhang等［5］发现，胃癌患者外周血Th17细胞比例较健康对照组增高，且Th17细胞比例增高的程度与胃癌的临床分期有关，认为Th17细胞可能促进胃癌的病理进展。Le Gouvello等［7］发现，结肠癌患者肿瘤组织内Th17细胞的比例明显高于自身正常结肠内的Th17水平。与结肠癌中的发现相似，Zhang等［8］研究证实，肝细胞癌患者的肿瘤组织与非肿瘤组织相比，Th17细胞水平也升高。另有Sfanos等［9］报道Th17细胞参与前列腺癌的发生、发展。

本研究结果显示，食管鳞癌患者外周血单个核细胞中Th17细胞占CD+4T细胞的比例显著高于健康对照组，因此，我们推测Th17细胞在食管鳞癌的发展过程中可能起着重要作用。同时，结合患者的临床及病理资料，我们发现食管鳞癌患者外周血中Th17细胞的比例与患者的年龄、性别及肿瘤的位置、大小、浸润深度、分化程度无明显相关性，而与肿瘤的TNM分期及有无淋巴结转移明显相关。此结果提示我们，食管鳞癌患者外周血中Th17细胞的比例显著增高是食管鳞癌的后期事件，在肿瘤发生的早期，癌肿对全身免疫系统的影响不明显，而随着癌肿的不断进展，可影响到全身，使Th17细胞不断增加，进而导致患者外周血中Th17细胞比例进一步增高。因而，我们认为Th17细胞参与了食管鳞癌的病理进展，检测其水平对于判断病期及预后有一定价值。

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