血清抗碳酸酐酶Ⅲ抗体ELISA检测方法的建立与初步应用

(首都医科大学宣武医院，北京 100053)

碳酸酐酶(CA)是一组含锌的金属酶，广泛参与机体的多种生理过程［1，2］。研究表明，抗CAⅡ和抗CAⅣ抗体参与系统性红斑狼疮、自身免疫性胰腺炎、硬皮病、子宫内膜异位症等疾病的发生发展［3～6］。但国内尚无自身免疫疾病患者和健康人群的血清CAⅢ抗体水平的报道。2009年5月～2010年2月进行本研究，着眼于建立适用于临床的抗CAⅢ抗体的ELISA检测方法，并对健康人群和自身免疫疾病患者抗CAⅢ抗体水平进行初步调查。

1 资料与方法

1.1 临床资料 系统性红斑狼疮患者40例，男7例、女33例，年龄20～35岁、平均29岁;皮肌炎患者9例，男3例、女6例，年龄25～35岁、平均31岁;高血压肾病患者30例，男女各半，年龄65～75岁、平均70岁;2型糖尿病肾病患者30例，男18例、女12例，年龄65～75岁、平均68岁;选取性别、年龄匹配无上述疾病的健康人为对照。所有受试者均知情同意。按照已建立的方法分别使用小牛血清和健康人血清为阴性对照，对上述人群血清的抗CAⅢ抗体水平进行测定，根据健康对照测定均值+2SD 确定 cutoff值［6］。

1.2 实验材料 酶标板，Costar;洗板机，雷杜RT-3000;酶标仪，雷杜RT-6000。重组人CAⅢ(33.9 kDa，货号:ab82823)，abcam公司;小鼠抗人 CAⅢ单克隆抗体(货号:ab54913)，abcam公司;抗CAⅣ抗体(货号:sc-25598)，Santa Cruz公司;HRP标记的二抗、四甲基联苯胺，KPL公司;Tween-20、小牛血清、H2O2，上海生工;其他为国产分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 ELISA操作步骤 根据预实验结果，使用包被缓冲液稀释CAⅢ至5 μg/ml;包被的酶标板用保鲜膜封好，置4℃过夜;使用洗涤液缓冲液清洗5次，每孔加入封阻缓冲液，于室温下放置30 min，用洗涤液洗板5次;每孔加入100 μl经1∶50稀释后的血清样品及阴性对照，室温(20℃)放置1 h，洗涤缓冲液洗板5次;每孔加入封闭缓冲液稀释的二抗100 μl，室温放置 1 h;每孔中加入 100 μl底物缓冲溶液，室温避光反应30 min;每孔加入25 μl终止液，读取450 nm处(参考波长630 nm)OD值。

1.3.2 抗体工作浓度的确定 抗原包被浓度为5 μg/ml，标准样品按照 1∶1 000～1∶32 000 倍比稀释，在每个标准样品倍比稀释孔中分别使用不同稀释倍数(1∶500～1∶8 000)的酶标二抗，其他实验条件一致，比较各孔450 nm处(参考波长630 nm)OD值，确定酶标二抗的稀释倍数，最后建立标准方程。

1.3.3 方法学考证 精密度:取高(OD=3.0)、中(OD=1.2)、低(OD=0.5)3 个浓度的标准品，每份样品同批测定20次，计算批内精密度;每份样品每天测定1次，连续测20 d，计算批间精密度。稳定性［7］:①试剂稳定性:新鲜配制的试剂置4℃冰箱，分别于第2、4、8、15和30天测定同一中值标准品，计算变异系数;②标本稳定性:3份OD中值患者血清分装为2组，第1组保存于室温(约20℃)，并于第2、6、12小时进行测定，第2组保存于4℃，于第6、12、24 小时进行测定。灵敏度［8］:使用公式OD灵敏度=OD零剂量+t0.95×SD/n 计算 95%可信区间下的灵敏度(n=20)。回收实验:测定中值抗CAⅢ抗体标准品，后于该标准品中加入高浓度抗CAⅢ抗体溶液，使其终浓度计算值为中值标准品的110%，根据前后测定结果计算回收率。干扰实验:标本性状的干扰:分别使用正常、乳糜、黄疸及溶血的血清标本(排除自身免疫性疾病)稀释抗CAⅢ抗体标准品，使用已建立的方法分别对其进行检测;CA同工酶的干扰:分别对抗CAⅣ抗体(1∶100稀释)及抗CAⅣ抗体中值标准品与抗CAⅢ抗体(最终稀释倍数为1∶100)的混合物进行检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行One-Way ANOVA分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA标准曲线方程的建立 方阵滴定实验结果显示，OD值在酶标二抗稀释倍率为1∶2 000～1∶4 000时开始出现明显变化，考虑其OD值应大小适中，选择酶标二抗的稀释倍数为1∶2 000。在上述反应条件下，以抗CAⅢ抗体标准溶液稀释倍数(T)的自然对数(logeT)为横轴，以OD值A为纵轴，使用SPSS11.0软件绘制标准曲线，结果显示logeT与其OD值之间存在良好的线性关系，R2=0.95，标准方程为:Y= －0.13logeT+1.59。

2.2 方法学评价 3个水平标准品的批内精密度为 5.6%～6.7%、平均 6.2%，批间精密度为 7.5%～8.8%、平均 8.2%。灵敏度为 0.025。试剂稳定性和标本稳定性试验中，各个时间点测定结果之间的变异程度均低于10%。经测定并计算，回收率为106%。血红蛋白浓度为12 g/L的溶血标本、甘油三酯为23.5 mmol/L的乳糜标本、胆红素为571 μmol/L的黄疸标本及抗CAⅣ抗体均不能对本实验造成显著影响。

2.3 临床样本检测应用 分别使用小牛血清和健康人血清作阴性对照，前者的测定结果略低但不存在显著性差异，为减少基质效应的影响，对患者标本进行测定时均使用健康人血清为阴性对照。糖尿病肾病组的血清抗CAⅢ抗体水平(0.33±0.06)高于健康对照组(0.03 ±0.02)(P ＜0.05);高血压肾病组的血清抗CAⅢ抗体水平(0.04±0.02)略高于健康对照组(0.03±0.02)，但无显著性差异(P＞0.05)。系统性红斑狼疮组的血清抗CAⅢ抗体水平(1.12 ±0.19)高于健康对照组(0.04 ±0.01)(P＜0.05)。抗CAⅢ抗体阳性率在系统性红斑狼疮患者为43%，糖尿病肾病患者为18%，皮肌炎、高血压肾病患者和健康对照未出现阳性结果。

3 讨论

自身抗体的检测在很多疾病尤其是自身免疫性疾病的诊治中的重要性日益凸显，CAⅢ抗体作为自身抗体的一种已经引起了很多科研工作者的重视［2］。但对其进行的研究大多还基于免疫印记、原位杂交等［3，9］，这些方法虽然灵敏可靠但操作复杂，成本偏高，不能广泛应用。目前国内并没有对CAⅢ抗体检测的试剂盒，本研究成功建立了人血清CAⅢ抗体的ELISA检测方法，其精密度、稳定性、抗干扰能力等技术指标均能满足ELISA常规检测的要求，且操作方法简单，检测结果稳定，所用试剂市场均有销售，检测成本与常规ELISA检测类似，可上机进行大批量分析，具备进入临床应用的潜质。

已有研究表明，抗CAⅢ抗体可出现于风湿性关节炎患者［9］，抗CAⅠ、CAⅡ和CAⅣ抗体可出现于自身免疫性胰腺炎患者［6］;人体内CAⅡ抗体与CAⅡ的结合可使CA发生空间构象改变并影响酶的活性位点，导致酶活性降低30%以上［5］，而抑制CA的功能可导致细胞内环境紊乱和功能障碍，甚至引起细胞内酸中毒［10］。人体内如果累积过多的抗CAⅢ抗体必然会与CAⅢ发生免疫反应，干扰CA的正常功能，进而可能对疾病的发生发展产生不利影响。

本研究结果提示，抗CAⅢ抗体可出现于系统性红斑狼疮患者和2型糖尿病肾病患者。由于细胞和体液免疫功能障碍，系统性红斑狼疮患者体内产生多种自身抗体，约50%患者有肾脏疾病临床表现，大部分患者在某一阶段发生一项或几项血液系统异常，CAⅢ在肾脏和红细胞中的含量较丰富，其自身抗体很有可能参与了本病的发生发展［11］。皮肌炎的主要特点是肌肉和皮肤受累，较少累及CAⅢ含量较丰富的血液系统和肾脏，这可能是皮肌炎患者血清抗CAⅢ抗体与健康对照无显著性差异的原因。2型糖尿病肾病是2型糖尿病的重要慢性并发症之一，自身免疫在2型糖尿病肾病的发生发展中占据重要作用，细胞外基质在肾小球、肾小管聚集导致的肾小球硬化及肾间质纤维化是其特征性病理改变。研究表明［5］，当免疫复合物在肾单位沉积时，能刺激浸润的淋巴细胞及肾小球细胞释放炎症介质，包括补体、生长因子、血管活性物质、细胞活素类物质等，从而促进2型糖尿病肾病的进展。本研究发现2型糖尿病肾病患者血清中抗CAⅢ抗体浓度与健康对照组相比有显著差异，且与国外使用免疫印记方法进行的测定具有相同的变化趋势［12］，提示抗CAⅢ抗体可能参与了本病的发生发展。高血压肾病患者血清的抗CAⅢ抗体水平与对照组无显著性差异，这一结果从侧面印证了糖尿病肾病具备自身免疫性疾病的特点，因此使用本法对同时患有糖尿病和高血压的患者进行监测可能对确定其肾脏损伤的病因提供帮助。在健康对照组实验中，年龄较高受试者的抗CAⅢ抗体水平略高于低龄受试者，但不存在显著性差异，这种现象可能是增龄性的自身抗体水平升高所致。

目前国内外已有越来越多的学者关注CA自身抗体的研究，并在多种疾病中发现其自身抗体，但这些研究大都处于临床观察阶段，各型CA同工酶自身抗体的疾病特异性、对相关疾病发生发展的影响及其机制仍需进一步研究。

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