猪圆环病毒检测方法的研究进展

苗丽娟

（吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101）

猪圆环病毒（PCV）为圆环病毒科圆环病毒属，是迄今发现的最小的动物DNA病毒。该病毒基因组为单股环状DNA，无囊膜，粒子呈20面体对称，直径17～20 nm。根据PCV的抗原性、核苷酸序列及致病性，将PCV分成PCV1和PCV2两种基因型。PCV1无致病性，PCV2具有致病性。PCV2与近年来在世界各国普遍发生的PCV感染密切相关。该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。PCV2还可以造成育肥猪皮炎与肾炎综合征，并与怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤、新生仔猪腹泻病、增生性坏死性肺炎的发生密切相关。随着该病的出现，人们越来越重视对猪圆环病毒的研究[1]。

PCV在临床症状上容易与一些疾病混淆，如猪瘟等。仅通过临床症状、病理剖检很难做出准确诊断，因此实验室诊断方法是PCV的重要诊断方法。诊断PCV的方法大致分成血清学方法与分子生物学方法两类。血清学诊断方法包括免疫组织化学检测（IHC）、酶联免疫吸附方法（ELISA）和间接免疫荧光（IFA）等。分子生物学诊断方法包括PCR、RT－PCR和荧光定量PCR等，是通过检测组织病料及病毒培养物中的病毒核酸来判断的，还可以采用病毒的分离与鉴定的方法。

1 病毒的分离与鉴定

将病死猪组织（肺、淋巴结等）与PBS 1∶5研磨，冻融3次，8 000 rpm离心15min，取上清。接种于无PCV污染的PK－15细胞，同时加入1/10体积的300mmol·L－1D－氨基葡萄糖。通常在病料接种后3 d，通过IFA、PCR或电子显微镜观察等方法确认病毒分离情况。病毒分离费时费力，不适于疾病的快速诊断。

2 血清学方法

2.1 酶联免疫吸附方法

酶联免疫吸附方法（ELISA）是以抗体抗原反应为原理的技术，是继免疫荧光和放射免疫技术之后产生的一种检测抗体或抗原的免疫酶技术，该技术简单、灵敏、快速。血清学方法中最主要的是ELISA法，主要包括竞争ELISA、间接ELISA、抗原捕获ELISA等。

2.1.1 竞争ELISA

竞争ELISA主要用于测定小分子抗原及半抗原。用特异性抗体致敏固相载体，加入含待测抗原的样品及一定量的酶标抗原共同培养，洗涤除去标记和未标记的抗原，加底物显色。Walker等首次利用PCV1和PCV2特异性单克隆抗体建立了竞争ELISA（c－ELISA）方法来检测PCV2抗体，并将这种方法和IFA方法相比，检测结果表明，该方法比IFA更敏感，可用于PCV2抗体的大规模检测[2]。

2.1.2 间接ELISA

间接ELISA主要用于测定抗体。用抗原致敏固相载体，然后加入待测抗体的血清，培养后洗去未结合成分，再加入酶标抗体，洗涤后加入底物，在酶的催化下底物发生反应，产生有色物质。Nawagitgul等报道了两种间接ELISA法，一种以细胞培养的PCV2全病毒作为抗原（PCV2－ELISA），另一种以ORF2重组杆状病毒表达产物作为包被抗原（ORF2－ELISA），分别用于检测针对全病毒和病毒核衣壳蛋白的抗体。试验结果显示，ELISA方法敏感性高、重复性好，并且与PPV及PRRSV的抗体无交叉反应[3]。但是，由于PCV2 ELISA不能有效区分PCV1与PCV2抗体，并且PCV2病毒培养物滴度低，纯化困难，因此该方法的应用受到很大限制。

2.1.3 抗原捕获ELISA

有研究人员利用单抗建立了抗原捕获ELISA方法检测PCV2特异抗体。McNeilly等以PCV2特异性单抗为工具建立了抗原捕获ELISA用于仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的诊断，发现抗原捕获ELISA与病毒分离、IHC一样能很好地鉴别PMWS与PCV2的亚临床感染[4]。抗原捕获ELISA的建立为PMWS与PCV2的亚临床感染的鉴别诊断提供了很好的手段。

2.2 间接免疫荧光

间接免疫荧光（IFA）主要利用已知抗原来检测待检血清的抗体，用于病毒分离效果的鉴定及病变组织或猪源细胞PCV感染情况的检测。陈庆新等将浙江省杭州地区28个猪场采集猪血清1 677份用IFA试验进行PCV2的抗体检测，检测出阳性血清960份，阳性率为55.48%，调查结果显示，杭州地区猪场为普遍感染[5]。这种方法成本低、简单、快速、灵敏，但实际操作复杂，因此不适合临床上的快速诊断。

2.3 免疫组织化学检测

免疫组织化学检测（IHC）与IFA一样，也是一种免疫染色方法，是在抗原抗体特异性反应的前提下，利用酶细胞化学的手段，检测抗原或抗体的一门新技术。IHC是可以对携带抗原的细胞及组织的形态进行大体的评价，而且在普通显微镜下就可以进行观察，且颜色稳定，样本易保存。有学者应用IHC法对PMWS患病猪的淋巴组织进行了检测，发现淋巴组织中单核巨噬细胞内和组织细胞内PCV2的阳性信号很强，说明PCV2主要存在这些细胞的细胞浆内。

2.4 免疫过氧化物酶单层试验

免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）是将生长有PCV病毒的PK－15细胞在96孔板上长成单层后，加入10倍稀释的待检猪血清，作用一定时间后吸干洗涤，再加入HRP标记的抗猪IgG，37℃孵育30min，吸干洗涤后加入底物溶液显色，然后终止反应。刘长明等在优化此检测方法的基础上，研制出一种新的IPMA抗体检测试剂盒，该试剂盒用于猪血清中PCV－2抗体检测，具有特异、敏感、操作简便、实用性强等特点[6]。

3 分子生物学诊断方法

主要应用分子生物学方法来检测组织病料或培养物中的病毒核酸。

3.1 聚合酶链反应

聚合酶链反应（PCR）是一种快速、简便、特异的诊断方法，可直接检测病毒核酸，在兽医临床检测病原中广泛应用。经过多年研究，已建立了多种形式的PCR方法，主要包括常规PCR、多重PCR、套式PCR、荧光定量PCR及PCR－RFLP等方法。

3.1.1 常规PCR

常规PCR是通过设计合成一对特异性引物，直接从病料或细胞中扩增PCV2特异的基因组片段，以达到特异检测PCV2的目的。Morozov从PCV－PK－15DNA链上设计特异性引物进行PCR反应，可直接检测组织病料及其细胞培养物中的病毒核酸。

3.1.2 多重PCR

多重PCR是一种特殊的PCR技术，主要是通过在同一反应中加入多对引物从而同时检测2种或2种以上病毒DNA。由于这种方法方便、快捷，已经广泛应用于医学临床，给疾病的快速诊断带来了方便。

3.1.3 套式PCR

套式PCR克服了由于组织病料或细胞中的PCV2模板DNA含量太少，而不能检测到PCV2基因组存在的特点。方法是设计两套引物，先用第1套引物进行PCR，然后取少量PCR产物作为模板，用第2套引物即套式引物再进行PCR。套式PCR较常规PCR及复合PCR更为敏感。

3.1.4 荧光定量PCR

荧光定量PCR方法具有良好的特异性和重现性，与普通PCR相比，特异性和灵敏度都更高一些，而且能够有效减少试验过程中产生的污染，便于观测，能实时地监测反应全过程。罗玉均等建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法检测PCV－2[7]。

3.1.5 PCR－RFLP分析方法

PCR－RFLP是指先以PCR快速而有效的扩增微量DNA，再利用限制酶进行多态性分析的试验方法。王新等借助RFLP方法对PK－15细胞、IBRS－2细胞以及疑似PMWS、猪皮炎肾炎综合征（PDNS）的病料进行了PCV检测以及血清型的鉴定[8]。

3.2 原位杂交

原位杂交（ISH）是利用核酸分子单链之间互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键形成稳定的杂交双链。ISH具有敏感性高和精确定位PCV病毒或PCV及PRRSV病毒DNA或RNA在细胞中的部位的特点，为进一步深入研究PCV的致病机理及与PPV或PRRSV之间的协同效应提供了帮助。肖驰等建立了CSF－PRRS－PCV2诊断DNA芯片，能同时检测 PRRS、CSF和PCV－2感染[9]。

4 小结

目前PCV2和其相关的疾病已在全世界范围内发生和流行，给养猪业造成了严重的威胁，引起了国内外学者的广泛关注。因此，建立一种简单、灵敏、经济、实用，适合临床推广的快速检测方法仍是目前研究的主要任务和方向。虽然目前检测PCV的方法很多，但各种方法都有其自身的局限性，因此要根据试验的目的要求，结合具备的条件选择适宜的检测方法检测PCV，做到早发现，早治疗，力争从根本上解决该病的防控问题。

[1]郭春艳,葛俊伟,李一经.猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达[J].东北农业大学学报,2009,40（6）:79－84.

[2]Walker IW,Konoby CA,Jewhurst V A,et al.Developmentand application of a competitive enzyme－linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to porcine circovirus type 2[J].JVet Diagn Invest,2000,12（5）:400－405.

[3]Nawagitgul P,Harms PA,Morozov I,etal.Modified indirect Porcine Circovirus（PCV）type 2－based and recombinant capsid protein（ORF2）－based enzyme－linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV[J].Clincal and Vaccine Immunology,2002,9（2）:33－40.

[4]McNeilly F,McNair I,O′Connor M,et al.Evaluation of a porcine circovirus type 2 specific antigen capture enzyme－linked immunosorbent assay for the diagnosis of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs:Comparison with viius isolution,immunohistochemistry,and the polymerase chain reaction[J].JVet Diagn Invest,2002,14（2）:106－112.

[5]陈庆新,商绍彬,叶菊秀,等.杭州地区猪Ⅱ型圆环病毒抗体的血清学调查[J].中国兽医科技,2003,33（7）:26－28.

[6]刘长明,张超范,危艳武,等.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学报,2007,29（8）:621－624.

[7]罗玉均,张桂红,陈建红,等.Taqman探针荧光定量PCR快速检测猪圆环病毒2型[J].中国兽医杂志,2007,43（1）:77－79.

[8]王新,郭万柱,徐志文,等.应用PCR－RFLP方法对四川猪圆环病毒的检测与分型研究[J].黑龙江畜牧兽医,2006（6）:77－83.

[9]肖驰,曹三杰,文心田,等.PRRS－CSF－PCV2诊断DNA芯片构建研究[J].畜牧兽医学报,2006,37（8）:799－803.