高同型半胱氨酸血症对雌激素受体α基因甲基化修饰的影响及其与脑梗死发病的关系

杨志甫，王丽珍 ，孟祥君，张茂林，席富强

(1包头医学院第一附属医院，内蒙古包头014010;2包头医学院病理教研室)

脑梗死是脑血管病中最常见者，发病率占脑血管疾病发病率的70% ～80%。研究证明，雌激素的血管保护作用主要是通过与雌激素受体α(ER-α)结合而介导的［1］。高同型半胱氨酸血症已被确立为脑梗死的独立危险因子［2］，但是有关其诱发脑梗死的机制尚未完全阐明。近年研究显示，高同型半胱氨酸血症也可能干扰基因的甲基化修饰进而引起某些基因的表达异常来促进疾病的发生发展。本研究从临床整体角度来探讨高同型半胱氨酸血症是否可通过干扰ER-α基因启动子区甲基化修饰，引起基因表达改变来促进脑梗死的发生发展，从而为脑梗死的预防和治疗提供新的思路和启示。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年9月～2011年2月在本院住院的脑梗死患者106例(脑梗死组)，均符合第四届全国脑血管病会议修订的标准并经CT或MRI检查证实。男69例、女37例，年龄41～84(63.54±11.36)岁。排除意识障碍或存在严重合并症而不能完成检查及神经功能评定的患者、心源性脑栓塞患者、存在严重肝病或感染者、严重营养不良或合并有免疫性疾病者。47例健康对照(对照组)来源于我院体检科，其中男30例、女17例，年龄39～82(60.06±11.67)岁。两组年龄、性别有可比性。

1.2 检测方法

1.2.1 ER-α基因启动子区甲基化状态的检测 抽取受试者清晨空腹肘静脉血2 ml，抽提基因组DNA按照TIANGEN公司试剂盒提供的方法进行。然后进行基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰及纯化，按照Promega公司A7280 DNA纯化试剂盒提供的方法进行，纯化后的DNA置－20℃保存备用。参考智艳芳等［3］方法，针对ER-α基因启动子区及第一外显子区CpG岛的序列完全甲基化和完全非甲基化两种情况，使用primers设计出ER-α基因甲基化特异性引物(ER-pM)和非甲基化特异性引物(ER-pU)。还需在ER-pM、ER-pU的外侧选择不含CG的区域设计一对外围引物，将修饰后的DNA进行第一轮扩增后再分别用ER-pM和ER-pM进行第二次扩增。引物由Invitrogen公司上海英俊生物技术有限公司合成。

巢式甲基化特异性PCR引物序列:巢式外围引物 ER-PN:上游:5'-GAGGTGTATTTGGATAGTAG-3'，下游:5'-AACTCCCTAAACTCTCCCTT-3'，扩增长度422 bp。ER-α甲基化引物:上游:5'-CGTCGTGTATAATTATTTCGAGGGC-3'，下游:5'-CTCGCGCACCGTATAACCGATAAAC-3'，扩增长度 283 bp;ER-α非甲基化引物:上游:5'-TGTTGTGTATAATTATTTTGAGGGT-3'，下游:5'-CTCACACACCATATAACCACTAAAC-3'，扩增长度 283 bp。反应体系:12.5 μl，第一轮使用外围引物ER-PN进行扩增，其中含有经亚硫酸氢钠修饰的 DNA 2 μl、Taq 酶0.5 μl、反应液10 μl，第二轮分别使用ER-pM和ER-pU进行扩增，模板为第一轮扩增后产物 2 μl、Taq 酶0.5 μl、反应液10 μl。反应条件:应用 Touchdown-PCR进行扩增，第一轮PCR:94℃预变性5min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸lmin，以后每个循环退火温度降低1℃，经20个循环后退火温度降至45℃;94℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸 lmin，20个循环;72℃延伸7min。以第一轮PCR产物2 μl为模板，分别使用ER-pM和ER-pU进行第二轮扩增，同样用 Touchdown-PCR，条件同第一轮。取 6 μl PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察。

1.2.2 同型半胱氨酸(tHcy)的检测 采用荧光生化法检测血tHcy浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件，计量资料以±s表示，正态分布计量资料组间均数比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验;相关性分析采取Spearman秩相关。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死患者血Hcy浓度与ER-α基因启动子区甲基化状态的相关性 脑梗死组tHcy浓度为(16.18 ± 6.06)μmol/L，对照组为(9.61 ± 3.12)μmol/L，前者明显高于后者(t=7.019，P=0.00)。在脑梗死组，ER-α基因启动子区未发生甲基化的脑梗死患者38例 tHcy浓度为(12.14±3.48)μmol/L，46例半甲基化的脑梗死患者为(15.86±3.56)μmol/L，22例全甲基化的脑梗死患者为(23.83±6.65)μmol/L。将脑梗死患者ER-α基因启动子区甲基化状态和tHcy浓度进行Spearman秩相关分析，结果显示，两者呈高度正相关(r=0.733，P=0.00)。

2.2 两组ER-α基因启动子区甲基化状态的比较脑梗死组有68例发生了甲基化，其中完全甲基化22例、半甲基化46例，甲基化率为64.2%;对照组有10例发生了甲基化，其中完全甲基化3例、半甲基化7例，甲基化率为21.3%。脑梗死组甲基化发生率显著高于对照组(χ2=22.27，P=0.00)。

3 讨论

脑梗死是脑血管病中最常见者，探讨脑梗死的发病机理，制定有效预防及治疗措施是当今医生和学者的重要任务。Leno等研究发现，女性卒中危险性低于男性，但在绝经后几年这种差异消失。Dubal等动物实验表明，雌性动物缺血后脑损害较雄性动物轻，这种现象随雌性动物衰老和内源性卵巢激素的去除而消失。这些研究均提示雌激素有脑保护作用。而雌激素的脑血管保护作用是通过雌激素进入细胞后与受体结合，形成激素—受体复合物，再进入细胞核，诱导功能不同的蛋白质合成来发挥的。与雌激素结合的受体包括ER-α和ER-β两种，体外实验已证明雌激素的血管保护作用主要是通过与ER-α 结合介导的［4］。

Hcy作为一种非蛋白质组成氨基酸，系各种转甲基代谢(包括DNA的甲基化修饰)的甲硫氨酸循环的中间产物。既然Hcy是甲硫氨酸循环的重要一环，其异常升高则很可能影响DNA的甲基化过程，并进而影响某些基因的表达而促进疾病的发生发展。大量研究表明，高同型半胱氨酸血症是脑卒中发生的一个重要危险因素。它是否会导致包括ER-α基因在内的很多功能基因启动子区CpG岛发生甲基化修饰，从而使基因表达沉默，进一步导致脑梗死，本文进行了相关探讨。

本研究结果显示，脑梗死患者ER-α基因启动子区甲基化率明显高于对照组，且脑梗死患者ER-α基因启动子区甲基化状态和tHcy浓度呈高度正相关，提示高同型半胱氨酸血症可能通过对ER-α基因表达调控区的甲基化修饰而降低雌激素的脑保护作用，从而导致脑梗死发病，这可能是高同型半胱氨酸血症作为脑梗死独立危险因素的又一机制。对于雌激素水平正常的绝经期前的女性脑梗死患者，是否ER-α基因启动子区发生甲基化致雌激素表达下降更有意义，有待于进一步深入研究。

［1］Babilcer FA，De Windt LJ，Van EM，et al.Estrogenic hormone action in the heart:regulatory network and function［J］.Cardiovasc Res，2002，53(3):709-719

［2］Coll BMM，Malionow MR，Beamer N，et al.Hyper homocysteinemia as a risk factor for occlusive vascular disease［J］.Stroke，1990，21(3):572-576.

［3］智艳芳，黄彦生，李著华，等.动脉粥样硬化病人雌激素受体α基因甲基化与高同型半胱氨酸血症关系的研究［J］.卫生研究，2008，37(3):314-317.

［4］Huang YS，Peng KJ，Wang SR，et al.Different effects of homocysteine and oxidized low density lipoprotein on methylation status in the promoter region of the estrogen receptor gene［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2007，39(1):19-26.