食管癌组织中ABCG2的表达变化及意义

罗俊辉,邹良健＊,黄盛东,龚德军,刘广洛,马春生

(1第二军医大学长海医院,上海 200433;2中国人民解放军第 150中心医院)

ABCG2作为一种重要的肿瘤多药耐药蛋白,不仅在肿瘤的多药耐药中发挥作用,而且还是肿瘤干细胞的候选标记物[1]。对其在肿瘤细胞中的分布及作用进行研究具有重要意义。本研究观察了食管癌组织中ABCG2的表达变化,并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 标本收集 80例新鲜食管癌及癌旁正常食管组织来源于长海医院胸心外科2006年 1月 ～2007年1月行食管癌根治术的患者(所取标本均经患者知情同意),术后均经病理学检查确诊。手术切除肿瘤标本5m in内,用无菌手术刀片切取数块1 cm×1 cm ×1 cm的肿瘤组织(避开坏死部分)和距肿瘤组织尽量远的正常食管组织,立即置于液氮中保存。患者均行电话随访,了解术后生存时间(至2009年1月)。

1.2 ABCG2检测 ①免疫组化染色：将组织从液氮中取出,常规石蜡包埋及切片,HE染色。用Envision法行ABCG2的免疫组化染色：切片置入0.01 M柠檬酸盐缓冲液中,煮沸 20min修复抗原,血清封闭液封闭20min,一抗采用抗兔ABCG2单克隆抗体,DAB显色,苏木精衬染,封片后在显微镜下观察。不加一抗作空白对照,人胎盘作阳性对照。ABCG2阳性表达为细胞膜及细胞质内有棕黄色颗粒。利用数码相机拍摄切片的高倍视野(×400)病理照片,在电脑上计数ABCG2阳性细胞。每个病例取3张切片(正常组织和癌组织各 3张),每张切片取 5个高倍镜视野计数阳性细胞数,取其平均数(每高倍视野),并按照以下标准确定该例的ABCG2分级：无阳性细胞为-(0级),阳性细胞1～30个为+(1级)、31～60个为++(2级)、61～90个为+++(3级)、90个为++++(4级),这样80例病例均得出癌组织和正常组织的ABCG2分级,然后计算出80例癌组织的ABCG2平均分级。②West-ern blot检测：采用ODG buffer裂解法提取组织蛋白质,用10%分离胶及 4%浓缩胶,100 V电泳约100 min,转移至PVDF膜,封闭液封闭,放置过夜;次日加稀释ABCG2一抗(1∶1 000)、内参一抗(1∶400),温育1.5 h,TBSB清洗3次后加二抗(1∶4 000),温育1.5 h后化学发光、显影、定影。用UVP凝胶成像系统Labworks4.6软件分析目标蛋白条带的灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。用配对t检验确定ABCG2在食管癌及癌旁正常食管组织中的差异,用χ2检验及Wilcoxon秩和检验分析ABCG2的表达与食管癌临床病理参数的关系。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织分型 所有标本均经HE染色确定病变类型,并明确正常组织无肿瘤侵犯。高分化鳞癌 22例,中分化鳞癌 48例,低分化鳞癌 10例。

2.2 免疫组化检测ABCG2在食管癌组织中的表达在正常食管组织中,ABCG2主要位于食管上皮的棘细胞层,为连续性,以胞膜着色为主;在癌组织中, ABCG2多为巢团状分布,主要定位于癌细胞,尤其定位于癌巢的中心部位及正在分裂的细胞,胞膜及胞质均有着色,在癌组织的血管内皮也可见有ABCG2表达。有40例癌组织检测到ABCG2(占50%),而在癌旁正常食管组织中有 27例检测到ABCG2(占33.75%),两者相比,P＜0.05。癌组织ABCG2表达的分级为0.84±0.99级,正常食管组织为0.43±0.73级,两者相比,P＜0.05。在低分化的食管癌组织中,ABCG2的表达较高、中分化食管癌的ABCG2表达升高,但两者相比,P＞0.05。

2.3 Western blot检测ABCG2在食管癌中的表达80例食管癌组织与正常组织中ABCG2和β-actin产物条带积分光密度值之比分别为0.37±0.19和0.30±0.15,ABCG2在癌组织中的表达水平为正常组织的1.22倍,两者相比,P＜0.05。

2.4 ABCG2的表达与食管癌患者预后的关系 ①免疫组化染色结果表明,术后3 a之内死亡的患者癌组织中 ABCG2的表达量较生存组患者高(ABCG2表达-、+、++、+++、++++者死亡组分别为 11、17、8、5、2例,生存组分别为 29、6、1、1、0例),即患者的3年生存率与ABCG2的表达程度有关(P＜0.01)。ABCG2在癌组织中的表达量与癌病变位置、TNM分期以及患者的性别、年龄无关(P均＞0.05)。②Western blot结果表明,食管癌组织中ABCG2表达上调(T/N＞1)与患者的术后早期复发密切相关(T/N＞1者61例,其中术后早期复发27例、未复发34例;T/N＜1者19例,其中早期复发2例、未复发 17例;两者相比,P＜0.01),而与患者年龄、性别、病程、病变部位、病理分型、TNM分期、分化程度及与患者是否接受术前化疗等无关(P均＞0.05)。

3 讨论

造成食管癌手术治疗失败的主要原因是术后复发。而造成食管癌术后复发的主要原因是体内残存癌细胞,包括在局部的癌细胞残留和未被发现的淋巴结转移。尽管手术加术后化疗在理论上可以清除所有癌细胞,但由于肿瘤的耐药导致部分癌细胞无法被清除,而成为肿瘤复发的根源。

ABCG2是介导肿瘤多药耐药的一个基因,分布于许多正常组织及肿瘤中。在正常组织中高表达于胎盘合体滋养层、小肠、大肠上皮、脑和前列腺等,而在乳腺、肝脏、肺等组织中低表达(局部有高表达)。其同样存在于乳腺癌、胃癌、大肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌及肺癌等实体瘤中[2,3]。表达 ABCG2的细胞对米托蒽醌、柔红霉素、阿霉素、拓扑替康、sN-38(伊立替康的活性代谢物)等药物耐药,但其对长春新碱、紫杉醇和顺铂依然敏感[4]。ABCG2在毛细血管或小静脉内皮细胞中的表达可能会对Western blot或PCR的检测结果造成干扰,用免疫组化的方法可以确定肿瘤组织中ABCG2的表达并非是毛细血管或小静脉内皮细胞的作用,而是组织本身的表达。

与其他的大部分ABC转运蛋白不同,ABCG2除了作为细胞耐药的药物转运蛋白,还与干细胞及肿瘤干细胞的功能及鉴定密切相关[5]。本研究免疫组化结果表明,ABCG2主要分布于食管癌增生活跃的部位,而且在食管癌组织中表达的高低与患者的中期生存率有关。患者手术后的中期生存率和患者体内残存的癌细胞的增殖及转移速度有关。高表达ABCG2的患者较低表达患者的中期生存率低,复发率则较低表达ABCG2的食管癌患者要高,说明ABCG2在食管癌的转移及复发中扮演了重要的角色。这种作用的形成可能与ABCG2本身是一种耐药蛋白有关,他的升高也伴随着食管癌耐药性的升高,导致癌细胞对多种化疗药物产生耐药性。但ABCG2并不转运当前食管癌中常用的铂类,因此,患者预后差很可能和 ABCG2的其他特性有关。ABCG2本身并不单纯是一种耐药蛋白,它还是一种潜在的肿瘤干细胞标志物。研究发现,SP阳性细胞较SP阴性细胞高表达ABCG2,高表达ABCG2的癌细胞很可能是肿瘤干细胞[1,6,7,8]。肿瘤干细胞与肿瘤的发生、转移、复发等密切相关,且肿瘤干细胞是天然耐药的。在其他的一些肿瘤的研究中已经有类似的报道,如在多形性胶质细胞瘤的研究中,ABCG2阳性癌细胞较ABCG2阴性癌细胞的增殖速度和侵袭能力均有明显上调[9]。因此,在食管癌中, ABCG2的高表达说明肿瘤组织中可能存在有较多量的肿瘤干细胞,其增殖能力和侵袭能力较ABCG2阴性细胞升高,同时其耐药性也较ABCG2阴性细胞明显升高,导致肿瘤的早期转移及复发,降低患者的生存率。因此,ABCG2可以作为食管癌患者预后的预测因子之一。

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