不同缺血时段大鼠心肌组织中Nanog的表达变化及意义

(1新乡医学院第一附属医院，河南卫辉 453100;2新乡医学院基础医学院;3新乡医学院组织再生重点实验室)

心肌缺血可导致心肌细胞缺氧，引起某些核转录因子的激活，影响干细胞分化。目前研究发现［1］，作为一种调节干细胞自我更新的核转录因子Nanog在心肌缺血的发病机制中的起重要作用。Nanog是一种存在于哺乳动物多潜能细胞和发育中的胚胎细胞中的同源结构域蛋白，它不仅对胚胎细胞的形成特别重要，而且对体细胞多潜能表达也起调节作用［2］。2009年8月～2010年3月，我们采用RT-PCR和Western blot法观察急性心肌缺血损伤大鼠心肌组织中Nanog mRNA和蛋白表达变化，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理 选用健康SD雄性大鼠30只(河南省实验动物中心提供)，体质量180～220 g。随机分为假手术组(正常组)和Q1、Q2、Q3、Q4组，各6只。后四组采用冠状动脉前降支结扎法建立心肌缺血模型［3］，以结扎后心前壁颜色变暗和ST段明显抬高0.15 mV确定建模成功。正常组除不结扎冠状动脉前降支外，余相同。

1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒，Nanog兔抗鼠多克隆抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG，PVDF膜(孔径0.45 μm，ECL-Western blot试剂盒等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 各组心肌组织中Nanog mRNA及蛋白检测

1.3.1 各组心肌组织中Nanog mRNA检测 取正常组心肌组织，Q1、Q2、Q3、Q4组分别于心肌缺血2、6、12、24 h时取心肌组织，采用 RT-PCR 法检测。先提取组织中的总RNA，逆转录合成cDNA，半定量RT-PCR扩增 Nanog、β-actin cDNA片断。Nanog上下游引物序列分别为5'-ATGCCTGTGATTTGTGGGCC-3'、5'-GCCAGTTGTTTTTCTGCCAC-3'，β-actin上下游引物序列分别为5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'、 5'-GCTCAGGATCTTCATGAGGT-3'。PCR反应条件:95℃预变性3 min，94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。予以1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果拍照后用图像分析灰度扫描，进行半定量分析。以Nanog与β-actin PCR产物条带灰度值比值为Nanog mRNA相对表达量。

1.3.2 各组心肌组织中Nanog蛋白检测 各组心肌组织提取同1.3.1。所有标本－78℃保存，采用Western blot法检测各组心肌组织中Nanog蛋白。以β-actin为内参照。将蛋白印迹显影图像扫描，用Image J图像分析软件进行半定量分析，以Nanog蛋白灰度值与内参照 β-actin灰度值比值为Nanog蛋白相对灰度值(灰度值与蛋白表达量成反比)。

2 结果

2.1 各组心肌组织中Nanog mRNA表达结果 正常组和 Q1、Q2、Q3、Q4组心肌组织中 Nanog mRNA相对表达量分别为 0.14 ±0.04、0.15 ±0.04、0.51±0.07、0.34 ± 0.04、0.11 ± 0.04。以 Q2、Q3 组Nanog mRNA表达最高(P均＜0.05)。

2.2 各组心肌组织Nanog蛋白表达结果 正常组和Q1、Q2、Q3、Q4组心肌组织中Nanog蛋白相对灰度值分别为 3.46 ±0.37、2.59 ±0.09、2.14 ±0.98、2.44 ±0.31、3.53 ±0.55。以 Q2、Q3 组蛋白表达最高(P 均 ＜0.05)。

3 讨论

有研究认为［4］，Nanog基因是“逆转因”物质，可以把普通细胞转变为胚胎细胞，再指导新细胞生长出人类需要的各种人体组织，来代替已失去功能的组织器官。最新研究表明［5］，Nanog与另两个重要核转录因子Oct4、Sox2同位于细胞全能性调控网络的顶端，是保持胚胎干细胞自我更新和多能性的中心物质，它们与多条信号转导通路中的蛋白或转录因子构成庞大的调控网络共同调节ES细胞的自我更新和全能性;同时通过调控在生物发育进程中起关键作用的可阻遏基因从而调节与分化有关的下游基因，调控生物的发育过程。

本实验中，我们首先建立了急性心肌缺血模型，采用RT-PCR和Western blot方法从基因和蛋白水平对缺血心肌组织中Nanog进行研究。本研究结果显示，正常组大鼠心肌组织中Nanog mRNA和蛋白呈微量表达，心肌缺血后2～12 h，心肌组织中Nanog mRNA和蛋白表达逐渐增加，以6～12 h增加显著，12 h后有所下降，24 h时呈几乎不表达，提示心肌缺血组织中Nanog表达明显上调，其原因可能是心肌损伤后的修复反应，Nanog高表达有利于心肌细胞增殖［6，7］。目前有关Nanog蛋白的作用靶点尚不十分清楚。Nanog蛋白作为一种转分化抑制因子，并不终止已定型的终末分化细胞，因此高度分化的心肌细胞，还可重新启动Nanog基因，合成Nanog蛋白，调节和促进心肌细胞再进入分裂循环［8］。

所以我们推测Nanog是心肌缺血后心脏病理生理改变的重要因素之一。缺血心肌组织中Nanog表达变化，可能在缺血后心肌重构过程中有着重要的作用，至于其作用机制及对心功能的影响等尚待进一步研究。

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