人肥大细胞羧肽酶真核表达重组质粒DNA的免疫原性观察

(广东医学院医学检验学院，广东东莞 523808)

肥大细胞(MC)是一类重要的免疫细胞，在超敏反应、肿瘤等疾病的发生发展中通过活化MC产生并释放炎症介质而发挥重要作用［1］。MC羧肽酶(MC-CP)是MC特异性蛋白酶，是过敏反应性疾病的生物标志物［2，3］。天然MC-CP的纯化极为困难，我们曾用原核表达技术制备了重组人MC-CP(hMCCP)及其抗体，通过原核表达获取的hMC-CP重组蛋白不具天然构象，获取的hMC-CP抗体所针对的表位为线性表位［4］;而构象表位通常是优势表位，针对构象表位的抗体才具有更高的检测灵敏度。DNA免疫作为一种以核酸为基础的全新免疫接种技术，外源基因在小鼠体内表达出具有天然构象的蛋白，激发机体发生免疫应答，并可用于抗体的制备。基于难于获取具有天然结构的hMC-CP，为进一步获取针对构象表位的hMC-CP抗体，2010年8月～2011年3月，我们进行了hMC-CP真核表达重组质粒DNA的免疫原性研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 pcDNA3.1载体、大肠杆菌DH5α，纯化的重组hMC-CP蛋白［5］以及分泌型hMC-CP真核表达质粒(pcDNA3.1/S-CP)［6］由本室制备并保存;pGEM-T载体，DNA 凝胶回收试剂盒与质粒抽提试剂盒，KpnⅠ、XhoⅠ限制性内切酶和T4DNA连接酶，无内毒素质粒大提试剂盒，DAB，HRP标记的羊抗鼠IgG，常规试剂为国产分析纯。PCR引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠，雌性，6周龄。

1.2 方法

1.2.1 hMC-CP编码区基因片段的扩增 以含hMC-CP基因的质粒［5］为模板，用以下引物做PCR扩增，P1:5'-GGTACCGCCGCCGCCATGAACTCATCCTGCCTGTGGG-3'(有下划线者为 KpnⅠ酶切位点)，P2:5'-CTCGAGTTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3'(有下划线为XhoⅠ酶切位点)。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，出现1条长约1 300 bp的条带，与预期结果相符。DNA测序结果表明，片段为1 269 bp的hMC-CP编码区基因与GenBank中公布的DNA序列完全一致。回收纯化PCR产物，与pGEM-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布于含 100 g/ml Amp和IPTG-Xgal的LB平板上37℃培养过夜，挑取单个白色菌落进行培养，提取重组质粒，以 KpnⅠ 和XhoⅠ进行双酶切鉴定;并选取阳性克隆行DNA测序，用Blast软件进行DNA序列同源性分析，阳性克隆命名为pGEM-T/CP。

1.2.2 非分泌性真核表达载体的构建 将质粒pGEM-T/CP和pcDNA3.1分别用KpnⅠ和XhoⅠ行双酶切，分别纯化、回收。回收产物经T4 DNA连接酶连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α。挑取白色菌落进行培养，提取质粒，双酶切鉴定后，阳性克隆行DNA测序鉴定，阳性克隆命名为pcDNA3.1/CP，约为1 300 kb的DNA片段，与预期结果相符;DNA测序结果表明，目的片段正确插入表达载体pcDNA3.1;Blast同源性分析显示，目的基因编码序列正确，阅读框正确，可用于进一步的重组表达。

1.2.3 免疫试验分组与处理 将40只BALB/c小鼠随机分为8组，各5只。其中4组采用肌注，另外4组则采用皮下注射。肌注:后肢胫前肌注射质粒100 μg/只(每条腿 50 μg)，4 组注射物分别为分泌性表达重组质粒pcDNA3.1/S-CP、非分泌性表达重组质粒组 pcDNA3.1/CP、pcDNA3.1 空白质粒、相同剂量NS。皮下注射:背部皮下多点注射，注射物分组同上。间隔免疫时间2周，共免疫3次。末次免疫后第7天摘眼球取血，分离血清，冻存备用。

1.2.4 免疫原性观察 用纯化的重组hMC-CP蛋白包被酶标板，采用间接ELISA法检测免疫血清的效价。反应完毕后，用酶标仪测波长450 nm处的OD值。以待检血清OD值＞阴性血清OD值2倍以上者的最大稀释倍数确定为其效价。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。数据比较进行两组独立样本的t检验。P≤0.05为差异有统计表意义。

2 结果

以 pcDNA3.1/S-CP、pcDNA3.1/CP DNA 免疫小鼠后，均诱导产生抗hMC-CP抗体，而pcDNA 3.1空载体和NS则不能。通过肌注途径，以pcDNA 3.1/S-CP免疫小鼠所得血清抗体效价均值为1∶6 400，以 pcDNA3.1/CP 免疫小鼠所得血清抗体效价均值为1∶3 200，两者比较，P ＞0.05。通过皮下注射途径，以 pcDNA3.1/S-CP、pcDNA3.1/CP DNA免疫小鼠所得的5份免疫血清抗体效价均值均为1∶3200，两者比较，P ＞0.05。同一载体肌肉与皮下免疫，所得血清抗体效价比较，P＞0.05。

3 讨论

MC-CP是MC的特异标志物，其检测有助于过敏性疾病的诊断，而高质量的抗体对提高检测的灵敏度和特异性具有重要作用。我们曾用原核表达制备了hMC-CP重组蛋白，并以之为免疫原制备其抗体，但为不具有针对抗原构象表位的抗体［4］。其原因可能为原核表达不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工，不能进行正确的折叠，不具有天然蛋白的结构。此后，我们尝试以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为宿主细胞进行体外真核表达，未能获取具有活性的重组hMC-CP，可能与该蛋白的加工成熟机制尚不清楚有关。有研究表明［7］，MC-CP的加工成熟可能还需要MC细胞内其他酶的参与。DNA免疫将编码抗原基因的质粒DNA注入小鼠体内不仅可表达相应的转基因产物，同时还可激发特异性免疫应答的发生［8］。由于DNA免疫模拟了机体在自然状态下体内表达抗原及诱生免疫的过程，免去了繁琐的蛋白纯化步骤，只需将编码抗原的DNA片段克隆到真核表达载体上，提取重组质粒DNA免疫动物，即可产生针对该抗原的抗体。

MC-CP基因编码的产物是1个含417个氨基酸的酶原，由信号肽、活化肽和成熟酶组成，成熟MCCP才具有活性。为研究hMC-CP信号肽对其分泌表达是否有影响，我们曾成功构建了hMC-CP的分泌型真核表达载体［6］。本实验中，我们成功构建了hMC-CP的非分泌型真核表达载体。

基因免疫常用的注射途径有肌肉、皮内、皮下、脾脏、静脉、腹腔免疫等，其中以肌肉注射免疫途径较为常用。接种方法可用基因枪免疫、裸DNA免疫、脂质体包裹DNA免疫等，其中裸DNA免疫较为常用。本实验选择了以裸质粒DNA分别进行肌肉免疫和皮下免疫，分别以分泌型与非分泌型hMCCP真核表达载体的裸质粒DNA免疫小鼠，收集小鼠血清检测到抗hMC-CP抗体，二者的效价近似(P＞0.05)，相同质粒以肌肉和皮下途径进行免疫，获取抗体效价近似(P＞0.05)。提示，hMC-CP真核表达重组质粒DNA具有较好的免疫原性，表达质粒是否为分泌性表达不影响其免疫原性，其免疫原性也不受质粒DNA注射途径的影响。

［1］Nechushtan H.The complexity of the complicity of mast cells in cancer［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(5):551-554.

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［4］Zhou YC，Chen ZQ，He S.Preparation，characterization and epitope mapping of McAb specific to human mast cell carboxypeptidase［J］.Scand J Immunol，2006，64(10):564-570.

［5］陈章权，何素辉，陆田田，等.兔抗人肥大细胞羧肽酶抗体的制备与鉴定［J］.细胞与分子免学杂志，2007，23(9):859-861.

［6］陆田田，陈章权.人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建［J］.现代医药卫生，2008，24(22):3346-3348.

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