肿瘤组织内活性氧与乏氧诱导因子-1α的研究进展*

张 艳 靳卫国

(1.泰山医学院，山东 泰安 271000；2.聊城市人民医院，山东 聊城 252000)

氧是需氧生物必不可少的基本物质，需氧细胞在物质能量过程中，如果氧未被完全还原成水，可产生氧自由基，这些氧自由基可转变成一些非自由基氧活性物质，由于功能上的相似性，这些物质被统称为活性氧(reactive oxygen species ,ROS)，ROS对细胞功能如生长、转化、凋亡、癌变和衰老发挥重要的作用。乏氧是肿瘤微环境的基本特征，乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1) 是各种低氧诱导基因调节的关键转录因子, HIF-1 的作用主要取决于HIF-1α亚基的表达和活性。结合两者近年来的研究进展作简要综述。

1 活性氧概述

1.1 活性氧的产生和代谢

细胞的生存离不开氧的供应。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的以各种形式的氧自由基和非自由基形式存在的含氧化合物的总称。包括超氧阴离子( superoxide anion，O2ˉ)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)及脂质过氧化物(ROOH)。这是一类比分子氧化学反应性更活活泼的一类含氧物质，含有未成对电子，极不稳定[1]。

生理情况下，体内大约2%的氧消耗于线粒体内，线粒体是ROS产生的主要场所，呼吸链(MRC)[2]中的酶复合体Ⅰ和Ⅲ漏出的电子能与O2结合生成ROS。其他产生ROS的部位包括：NADH氧化物酶复合体途径[3]、磷脂酶A2激活的花生四烯酸代谢途径[4]、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶途径[5]、蛋白激酶C、脂氧合酶系以及环氧合酶系等，其中NADH氧化酶系统最重要。

机体在长期进化过程中形成了抗氧化应激机制，正常情况下，细胞产生的少量ROS 可被内源性抗氧化系统包括抗氧化酶和抗氧化物质灭活，从而保护细胞免受自身代谢产物的损伤[6,7]。这些抗氧化酶类主要包括：超氧化物岐化酶( superoxide dismutase, SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase, GPX)及过氧化氢( catalase, CAT)等，而抗氧化物质主要有：还原型谷胱甘肽( reduced glutathione hormone, GSH) 、硫氧还蛋白( thionredoxin, TRX) 、维生素E、胡萝卜素、维生素C及一些游离氨基酸、多肽及蛋白质等。

1.2 活性氧与肿瘤的发生机制

在病理情况下，如：氧分压改变、激素、细胞因子和化学物质等均可引起的ROS 增加。当体内ROS产生数量超过机体抗氧化能力，就会损伤蛋白质、DNA、多糖和脂质，该过程被称为氧化应激(oxidative stress)。随着ROS研究的不断深入，它在肿瘤发生发展过程中的重要作用已被证实，体内活性氧与抗氧化应激系统的失衡是肿瘤形成的关键因素，大量研究结果显示ROS参与肿瘤的发生发展过程[7-9]。

1.2.1ROS导致的DNA损伤 ROS是极强的氧化剂，当其在机体或细胞内聚集可造成DNA损伤，产生DNA断裂、碱基互换、姐妹染色体交换、DNA加合物形成、染色体基因突变等，这是ROS诱导细胞癌变的主要原因。ROS诱导的DNA氧化性损伤的主要方面是碱基结构的损伤，其中·OH是结构最简单 、反应活性最高的活性氧。ROS还可通过基因的转录和表达来调控细胞多种代谢过程。ROS可氧化DNA结合蛋白质的巯基，从而改变与DNA结合的能力，引发癌基因的表达。另外，活性氧以协同方式激活转录因子NF-KB 和MAP激酶(丝氨酸/苏氨酸激酶)，以启动基因的转录影响肿瘤细胞的增殖。

1.2.2ROS导致蛋白质损伤 活性氧对蛋白质的作用包括修饰氨基酸，使肽链断裂，形成蛋白质的交联聚合物，改变构象和免疫原性等5个方面。一是修饰氨基酸。蛋白质分子中起关键作用氨基酸成分对自由基损害特别敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最为突出，不同的自由基对特定氨基酸侧链有特殊影响。二是使肽链断裂。活性氧所致蛋白质肽链断裂方式有2种，一种是肽链水解，另一种是从α-碳原子处直接断裂，究竟以何种方式断裂取决于活性氧和蛋白质的类别、浓度和二者之间的反应速率。三是形成蛋白质交联聚合物。多种机制可以导致蛋白质的交联和聚合。蛋白质分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫键，两者均可以形成蛋白质的交联。交联可以分为分子内交联和分子间交联2种形式。蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸的数目可以决定交联的形式。另外，脂质过氧化产生的丙二醛与蛋白质氨基酸残基反应生成烯胺，也可以造成蛋白质交联。四是改变构象。蛋白质经氧化后，热动力学上不稳定，部分三级结构打开，失去原有构象。五是改变免疫原性。.

1.2.3ROS对生物膜的损伤 自由基作用于细胞膜及亚细胞器膜上的多不饱和脂肪酸，可使其发生脂质过氧化反应，脂质过氧化的中间产物可与膜蛋白发生反应生成蛋白质自由基，使蛋白质发生聚合和交联；另一方面自由基还可直接与膜上的酶或其受体共价结合。这些氧化损伤破坏了镶嵌于膜系统上的许多酶和受体、离子通道的空间构型，破坏膜的完整性，使膜流动性下降，膜脆性增加，细胞内外或细胞器内外物质和信息交换障碍，影响膜的功能与抗原特异性，导致广泛性损伤和病变。

1.2.4其它因素 研究表明，ROS可促使致癌物质产生。如：2-氨基-3,4二甲基异吡唑喹啉和2-氨基-3-甲基异吡唑喹啉等杂环胺类[10]。ROS也可影响端粒酶的活性，而端粒酶通过调控染色体端粒的长短来决定细胞的分裂、分化、衰老和死亡、以及癌变等多种过程。

2 乏氧诱导因子-1α

实体瘤的发生发展依赖于血供系统，新生的肿瘤脉管通常不规则、异常弯曲、动静脉短路或呈盲端或血管壁不完整，导致血流缓慢，肿瘤细胞所需的氧气和营养物质供应不足，乏氧是实体瘤微环境的基本特征，乏氧不仅改变肿瘤细胞的生物学特性，导致肿瘤细胞的遗传不稳定性及恶性选择，与肿瘤的生长、浸润和转移有关，也是肿瘤对放、化疗产生抗性的主要原因之一。

2.1 乏氧诱导因子-1α的结构与功能

在乏氧情况下，肿瘤细胞组织的许多基因都会对乏氧做出应激反应，在该过程中起中枢性调节作用的因子就是乏氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)。 HIF-1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,它是由α和β2个亚基组成的异二聚体。HIF-1α基因定位于染色体14q21～q24,而HIF-1β基因定位于染色体1q21。α和β2个亚基均属于碱性螺旋-环-螺旋/PAS ( bHLH-PAS)蛋白家族成员。HIF-1α分子的氨基端方向依次排列着碱性区域、HLH 和PAS,共同构成转录因子DNA结合结构域。HIF-1α羧基端有两个相对独立的反式激活结构域( transactivation domain, TAD) ,分别称之为TAD-N (氨基酸531～575)和TAD-C (氨基酸813～826) ,参与转录活化,二者之间为抑制结构域,能降低TAD的活性,常氧下抑制明显。HIF-1α分子中部是氧依赖降解结构域,控制其常氧降解。HIF-1α是HIF-1所特有的,它既是HIF-1的调节亚基,又是活性亚基,其蛋白稳定性和活性均受细胞内氧浓度的调节,在常氧条件下HIF-1α水平下降明显,很难检测到。HIF-1β是许多转录因子所共有的亚基,为芳羟受体核转位子( the aryl hydrocarbon recep tor nuclear translocator,ARNT)基因的产物,又称芳羟受体核转运蛋白,具有789或744个氨基酸残基,仅含一个转录激活区,定位于C末端。HIF-1β在细胞内呈构成性表达,不受氧浓度的调节,可存在于任何氧浓度下。只有HIF-1α入核后与HIF-1β形成异二聚体才能成为有活性的HIF-1[11]。研究证明：HIF-1α仅存在于乏氧细胞核内，常氧状态下检测不到，与肿瘤的增殖、浸润和转移能力有关。

乏氧状态下，肿瘤细胞的多种基因转录活性发生改变，这些基因的启动子多含有乏氧反应元件(HRE)，HIF-lα通过HRE调节多种靶基因如：VEGF、EPO、GLUT-1、3和糖酵解酶的表达，影响血管发生、细胞能量代谢、离子代谢、细胞周期、细胞凋亡、信号传导等。

2.2 HIF-1α与肿瘤的作用机制

2.2.1HIF-1α与肿瘤的血管生成

在众多调节中肿瘤血管形成的因子如：血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor, VEGF) 、表皮生长因子( ep idermal growth factor, EGF)和成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor, FGF)中,乏氧引起VEGF的表达上调已得到公认,上调的VEGF可协助肿瘤细胞进入脉管系统,从而增加肿瘤转移率。Fang等[12]证实,在肿瘤发生早期HIF-1α介导了VEGF的上调。Schoppmann等[13]研究发现, HIF-1α与VEGF-C有显著的相关性,且与微血管密度有明显关联。Skinner等[14]发现HIF-1α的表达通过活化P I3K/AKT信号通路在转录水平介导VEGF蛋白的表达。

2.2.2HIF-1α对肿瘤细胞间黏附的影响

当肿瘤细胞处于低氧状态时，肿瘤细胞间黏附力下降，同时侵袭组织和血管的能力增强。研究表明,在诸多与肿瘤细胞浸润转移相关的黏附分子中,上皮型钙粘素( E-cadherin, E-cad)与β链接素(β-catenin,β-cat)起重要作用, E-cad /β-cat复合体的破坏可使细胞-细胞、细胞-基质间的黏附性降低,最终导致细胞的分离和移动；同时两者亦是上皮-间质细胞转化( epithelial-mesen-chymal transition , EMT)中的关键蛋白,而EMT是肿瘤转移过程中的重要现象。HIF-1α可通过影响肿瘤细胞黏附分子的表达促进肿瘤转移。在晚期卵巢癌患者肿瘤组织中能检测到在H IF-1α高表达的同时, E-cad和β-cat在转录水平和蛋白水平表达降低。Imai等[15]应用Northern- blotting、RT-PCR和Westernblotting实验方法发现低氧环境下卵巢癌细胞系中E-cad的表达明显减少, 导致细胞间黏附作用减小,促进肿瘤侵袭, 可能是导致卵巢癌细胞侵润转移的始动因素, 同时发现其机制可能是乏氧上调Snail( E-cad转录抑制因子) 表达。Ohga 等[16]研究发现乏氧本身可直接激活NF-κB, 而ICAM-1( 细胞间黏附分子-1) 基因的启动子含有NF-κB 作用位点, 因此可认为乏氧通过激活NF-κB 进而促进ICAM-1的表达,促进肿瘤侵袭的发生。Howard等[17]研究发现乳腺癌中E-cad 的表达与HIF-1α的表达明显相关。

2.2.3HIF-1α对肿瘤细胞凋亡的影响

肿瘤细胞的凋亡有p53依赖性和非依赖性两条途径, 而乏氧是通过HIF-1α介导p53 依赖途径而发挥作用。Carmeliet 等发现乏氧时野生型胚胎干细胞(ES,HIF-1α+/+ ) 的HIF-1α和p53 表达均增加。研究表明HIF-1α可选择性地使p53 突变或p53 缺失的瘤细胞凋亡受阻, 使肿瘤恶性程度更高。Bcl-2为凋亡抑制因子, Bcl-2可通过抑制肿瘤细胞凋亡而增强膀胱癌的转移能力。Acs等[18]发现HIF-1α可调Bcl-2表达，抑制凋亡, 从而增强肿瘤转移能力。HIF-1α亦可上调凋亡抑制因子p21, 从而抑制凋亡使肿瘤恶性程度增加易于转移。

3 活性氧对HIF-1α的影响

HIF-1α有1 个氧依赖调节区(ODD) ，2 个转录活性区( TAD) 。正常氧分压条件下，ODD 的2 个脯氨酸残基( P402 和P564) 被脯氨酸羟化酶( PHD) 羟化，导致HIF-1α与抑癌蛋白VHL 结合，启动HIF-1α的泛素化和蛋白水解过程。在这一过程中，PHD被确定为氧感受器，其活性受氧分压调节。

而更多的研究发现，无论是缺氧或非缺氧情况，ROS 均参与HIF 活性的调节。研究表明 HIF-1α对氧依赖性较强，HIF-1α蛋白表达和转录活性在mRNA、蛋白、核定位及转录激活等不同层次受细胞内氧浓度的精确调控[19]，当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1α表达增加，与靶基因上的HRE结合[20],诱导下游靶基因的转录而产生一系列生物学效应,如：作用于促红细胞生成素( erythropoietin, EPO)使血红蛋白合成增加，增强在低氧环境下的携氧能力；增加与无氧代谢有关的基因转录(包括糖酵解酶、葡萄糖转运子等)而使ATP生成增加；上调血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达而促进肿瘤新生血管形成；此外还可调节多种基因的表达,如胰岛素样生长因子-2、内皮素-1、转铁蛋白、葡萄糖载体蛋白-1及细胞周期调节因子等,这些产物参与肿瘤细胞的代谢、生长、凋亡及浸润转移等。

研究表明，肿瘤细胞在乏氧状态下产生的ROS增多[21]，ROS可通过抑制 PHD活性对HIF-1α发挥正向调节作用。而在常氧状态下, 肿瘤组织内HIF-1α的含量与活性调节主要依赖生长因子、血管活性肽和金属离子等因素,这些因素可通过促进ROS的产生来发挥调节作用。另外，许多非低氧刺激因素,如凝血酶、血管紧张素和机械性刺激等，可通过NADPH氧化酶调节细胞内的ROS水平和HIF-1α[22]。总之，乏氧和非乏氧刺激因素均可增加ROS水平，通过PHD、激酶和磷酸酶等上游信号通路，正向调节HIF-1α水平和活性。

4 结论与展望

实体瘤的发生发展机制非常复杂，ROS及机体抗氧化系统的失衡在其中发挥重要作用，而乏氧是实体瘤发展过程中的普遍现象。具体机制未完全阐明，继发的组织低氧使适应低氧环境和低血糖的残存细胞克隆继续生长，这是肿瘤细胞浸润及其对放化疗抗拒的最根本原因。HIF-1α无疑成为肿瘤细胞克服缺氧，增强自身适应能力的枢纽环节。虽然目前我们对ROS及HIF-1α系统有了一定的认识，但仍有许多未解之谜：①HIF-1α具体的调控机制。②ROS及机体的抗氧化系统的调节。③ROS对HIF-1α作用的具体影响等。全面详尽地认识肿瘤内氧代谢异常，对我们认识和治疗肿瘤将开辟新的途径。

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