自体外周血干细胞与骨基质明胶复合移植治疗骨缺损

2011-04-13张小舟邹三明冯华明黄笃康照利

实用骨科杂志 2011年3期

张小舟,邹三明,冯华明,黄笃,康照利

(华中科技大学同济医学院附属孝感医院,湖北孝感 432000)

节段性骨缺损的治疗在临床骨科领域存在很大的困难。我们采用自体外周血干细胞(autologous peripheral blood stem cell,APBSC)与表面脱钙骨基质明胶 (bone matrix gelatin,BMG)共移植修复节段性骨缺损进行了临床研究,在课题研究中进行了X线检查,效果理想,达到了预期目的,在临床有广阔的应用前景,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2003年 12月至 2007年 12月我课题组共收治节段性骨缺损病例 36例(骨缺损长度选定为 6～12cm),男24例,女12例;平均年龄39岁(20～65岁)。其中,骨盆骨缺损3例,肱骨骨缺损9例,尺桡骨骨缺损 5例,股骨骨缺损 12例,胫腓骨骨缺损7例。骨肿瘤25例,骨折后骨不连 11例。

依据同种病情、患者自愿的原则,采用纳入法将 36例患者随机分为两组(即 A组和 B组)。

1.2 APBSC的采集[1]及手术方法患者入院后在常规术前检查和治疗原发病的基础上,手术前6d给予分泌型重组人粒细胞刺激因子,600 μg/d皮下注射,连用5 d。手术当日经美国Baxter公司生产的 CS3000PLUS血细胞分离机,分离出外周血干细胞悬液 50mL,采集后干细胞不做任何处理留置备用(外周血干细胞采集工作在孝感市中心血站实验室完成)。

根据患者骨缺损病变部位,采用相应的手术麻醉和手术切口,充分显露骨缺损部位,彻底清理骨缺损部位的软组织和病变骨组织。疏通上下髓腔,将骨断端修理成梯形以便充分嵌合,清洗术野。

根据骨缺损长度制备相应的 BM G(课题组所用 BM G均由医院指定的山西组织骨库制备、提供),将外周血干细胞悬液种入制备好的BMG中。A组患者将APBSC/BM G复合体充分嵌合于骨断端,B组患者仅使用 BMG嵌合于骨断端,根据骨缺损部位选择相应的钢板、螺钉或交锁髓内钉进行牢固内固定。

术野放置引流管,依次缝合各层组织,术毕。术后24h拔引流管,抗生素术后使用1周,术后 2周切口拆线。

2 结果

2.1 影像学观察术后1个月复查X线片显示：A组患者骨折端有骨痂形成;B组患者骨折端骨痂形成不明显,两组患者骨折处皆有压痛。2个月复查X线片显示：A组患者可见骨折端有大量骨痂形成,骨折处压痛不明显,此时开始功能锻炼;B组患者骨折端有骨痂形成,骨折处压痛较前减轻。3个月复查 X线片显示：A组患者可见骨折端有连续骨痂形成,骨折处无压痛;B组患者骨折端有大量骨痂形成,骨折处有轻微压痛。

2.2 愈合时间比较平均愈合时间 A组为 5个月,B组为 8个月,两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。在治疗期间,患者未见感染及其他并发症,随访12个月均未发生再骨折。

2.3 功能评估术后结果评定根据国际保肢学会功能评分标准[2]评定 ,术后依疼痛程度、功能活动、心理接受程度、是否用外部支持、行走能力和步态6个指标评价效果。每个指标分0、1、2、3、4、5分,共6级。总分30分,大于 24分为优,18～24分为良,小于15分为差。A组优 16例,良 2例;B组优14例,良4例,两组间差异没有统计学意义。

3 讨论

3.1 APBSC/BM G移植理论基础骨组织的再生要求有 3个基本的生物学因素参与,即细胞,生长调节因子,细胞外支架材料。种子细胞(成骨细胞)：理想的骨组织工程种子细胞应具备下列特点,即取材容易,对机体损伤小;在体外培养中易定向分化为成骨细胞和具有较强的传代繁殖能力;植入机体后能适应受区的环境并保持成骨的活性。目前发现种子细胞有以下几种来源,即胚胎骨、骨外膜、骨髓、骨外组织(包括外周血干细胞)。其中,外周血干细胞具有很强的传代繁殖和定向分化为成骨细胞的能力,植入机体后能适应受区的环境,保持成骨活性。生长调节因子：主要是生长因子和细胞因子,在组织工程中,某些种子细胞在体外传代培养后,经过一段时间细胞极易衰老,而生长因子能调节种子细胞的增殖和分化。对成骨细胞起着重要调节作用的生长因子有转化生长因子β、胰岛素样生长因子、骨形成蛋白、碱性成纤维细胞生长因子及血小板衍生生长因子等。细胞外支架材料：理想的组织细胞外基质材料必须具有如下特征,即良好的生物相容性,良好的生物降解性,具有三维立体多孔结构,良好的可塑性和一定的机械强度,良好的材料-细胞界面,材料须易于消毒。用于组织工程的支架材料有天然和人工合成两类,目前用于细胞支架材料的主要有聚乳酸、聚羟基乙酸及表面脱钙骨基质明胶。它们突出的优点是：生物相容性良好,降解速度可调,降解产物易于代谢和排除,以及材料易于消毒等。

干细胞又称为多潜能干细胞,主要来源于胚胎时期的卵黄囊,为骨髓的原始细胞。既往用于移植的干细胞主要采自骨髓,因此称为骨髓移植。然而随着血液学研究的进一步深入,有研究发现[3]干细胞不仅存在骨髓中,同时也存在于脐带血、胚胎肝脏及外周血中,骨髓移植这一较为片面的概念逐渐被干细胞移植所替代。APBSC来源于骨髓,与骨髓干细胞具有共同的生物学特征,既不断地自我更新,在造血组织中维持一定数量的能力,又有分化为骨髓红细胞系、粒细胞系、淋巴细胞系以及巨核细胞系的潜力[4]。有研究表明[5]外周血细胞的不同阶段,包括干细胞、前祖细胞及晚祖细胞,均有 CD34+细胞膜分化抗原,然而定向祖细胞却没有这种抗原,由此外周血干细胞可以由 CD34+细胞代表。正常情况下,外周血细胞中只有(0.2±0.1)%的 CD34+细胞[6],表明外周血中干细胞数量极低,远不能满足临床应用的需要。增加移植所需要外周血干细胞数的主要方法包括[1]：a)骨髓抑制性化疗药;b)造血因子：其中粒细胞集落刺激因子最常用; c)前两种联合应用,以上方法可使外周血干细胞增加数十倍,甚至数百倍。本课题组根据课题研究条件选择粒细胞集落刺激因子进行骨髓动员。目前从外周循环血中直接分离外周血干细胞的难度较高,本实验利用干细胞的大小与淋巴细胞接近的形态学特点,用淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞或单个核细胞,从而提取移植所需要的外周血干细胞[5,7]。

Chalmers等[8]提出骨形态蛋白、间充质细胞、骨生长环境是诱导成骨的三个关键要素,骨形态蛋白作为诱导刺激物作用于间充质细胞,在有利于骨生长的血液环境中,诱导刺激骨形成。 BM G含有骨形态蛋白,其由同种异体骨经过脱脂、表面脱钙、脱蛋白、脱细胞处理等处理后,去掉了除骨形态蛋白以外 95%的非胶原蛋白和具有阻滞作用的脂质成分[9]。有实验研究表明[10],BM G移植在短期(6～9周 )可以产生较大的骨诱导作用。BM G[11]的特点：既有强度又有孔隙;其免疫原性低,生物相容性好;与外周血干细胞及软骨细胞复合后具有较好的兼容性;能在体内逐渐吸收,被新骨所替代;来源广泛。因此,逐渐成为临床上常用的骨移植材料[12,13]。 BM G不用与任何移植材料的空白对照组比较,其疗效已被大量文献报告[14-16]所肯定。

骨折愈合是建立骨的连续性和恢复骨的生物学特性。APBSC/BMG复合移植治疗骨缺损,既利用了外周循环血中的多潜能干细胞,保留骨的生物学特性;又利用了 BM G中的骨形态蛋白,从而诱导成骨细胞形成[17,18]。APBSC在 BM G的骨形态蛋白诱导下具有明显的成骨作用。与单纯 BM G移植相比较,APBSC/BM G复合移植具有新骨形成时间更短、新骨形成质量更好的优点。

我们认为 APBSC/BMG复合移植具有广泛的临床应用前景,理由是：a)APBSC/BM G复合移植避免了传统手术中自体采骨给患者带来的痛苦以及供区新的骨缺损等一系列并发症,对机体创伤减小到最低限度,移植物处理达到几乎无创伤[14]。b)使骨缺损修复的手术难度降低。c)与同种异体骨或异种骨移植相比较,免疫排斥反应极小;与人工骨比较, BMG同时具有良好的生物相容性、生物降解性能,在体内吸收被新骨所替代[16,19]。d)BM G可塑形,APBSC/BMG复合移植不仅在骨科,还可广泛应用于颌面外科及整形外科。

3.2 异体骨的应用及内固定的选择自体骨移植是临床常用的修复骨缺损的方法。自体骨移植无免疫排斥反应,骨诱导作用好。若受床血供良好,有健康的软组织覆盖,则骨愈合快,效果令人满意。但骨源有限,并且会对供体造成新的缺损,而且人工替代物尚不适用于大段骨移植[20]。同种异体骨移植已有百年历史,近年骨库的发展使供体的选择、制备、灭菌和保存方法更加规范、严格。异体骨植骨量充足,形态可按需选择。另外,本组病例中我们采用了钢板、螺钉和牢固的绞锁髓内钉内固定,这些固定对于早期的异体骨愈合能起到较好作用。

3.3 骨缺损长度的选择课题组选择的病例骨缺损长度为6～12 cm,因为骨缺损在6cm以下可以通过截取自体髂骨填充缺损段达到较好骨愈合;对于12cm以上的缺损,血管化植骨优于游离植骨。所以两组病例我们都选择骨缺损长度为 6～12 cm具有可比性[21]。

3.4 APBSC/BMG临床应用前景 APBSC/BM G具有诸多优点,如 APBSC/BM G复合移植对机体的创伤大大减少,避免了传统手术中取自体骨给患者带来的巨大痛苦,也可减少供区产生新的骨缺损等一系列并发症;此方法使治疗骨缺损的难度降低;APBSC/BM G免疫排斥反应小,具有较好的生物相容性,可在体内吸收被新骨所取代;与商品化的人工骨相比,APBSC/BM G所需费用不高;另外,BMG具有可塑性,APBSC/BM G也可广泛应用于整形外科等领域。因此APBSC/BMG复合移植具有广泛的临床应用前景。

3.5 并发症 a)应用大块同种异体骨移植后的最主要并发症是排异反应继发的感染、骨不连、异体骨骨折等。本组 36例未见严重的排异反应继发的感染、骨不连、异体骨骨折。这种现象应与良好的固定保证了移植区域的稳定有关。b)在外周血干细胞动员时观察有无骨痛、乏力、皮疹、发热、胃肠道反应(恶心、呕吐、便秘)。c)在外周血干细胞分离及采集过程中观察有无低钙性口周麻木、抽搐,迷走神经反应性面色苍白,低血容量性面色苍白、晕厥[22]。d)肿瘤患者 APBSC移植后肿瘤可能复发。

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