衣霉素对RPMI-8226细胞分化的影响

谭建军，林 荣，侯俊丞，董浦江

(1.川北医学院附属三台医院血液内科，四川三台 621100;2.重庆医科大学附属第一医院，重庆市普外科学重点实验室，重庆 400016)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是起源于B细胞的恶性肿瘤。好发于中老年人，以骨痛为主要临床表现［1］。诱导分化治疗多发性骨髓瘤是一新的治疗领域。衣霉素(tunicqamycin，TM)是一核苷抗生素，它可通过抑制蛋白糖基化途径中的十四糖二磷酸长萜醇的生成，形成脱糖蛋白，阻碍内质网内新生蛋白质糖基化修饰，内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白蓄积，引起具有保护作用的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)发生［2］。UPR在具有分泌抗体的细胞分化中有着重要作用。本实验在重庆医科大学附属第一医院重庆市普外科学重点实验室完成，我们以小剂量TM诱导RPMI-8226细胞，探讨TM在诱导分化治疗多发性骨髓瘤中的机理，为临床应用提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

鼠抗人XBP-1u蛋白抗体、兔抗人CD49e抗体、兔抗人β-actin蛋白抗体(美国Santa cruz公司)，衣霉素(美国sigma公司)，测定免疫球蛋白轻链ELIAS试剂盒(美国GE公司)，APAAP试剂盒(医学科学院生物制剂中心)，电泳试剂盒(武汉博士得公司)，发光试剂盒(美国GE公司)，蛋白提取液(武汉博士得公司)，图像分析系统(美国BID-RAD公司Chemi DOCXRS)。

1.2 RPMI-8226细胞

为多发性骨髓瘤细胞株，购自中国医科院细胞库。用含10%FBS的1640培养液在37℃、5%CO2培养箱培养，成对数生长期时用于实验。实验组加TM，其终浓度0.4μmol/L，分别继续培养48小时与72小时。对照组加TM溶剂。

1.3 RPMI-8226细胞CD49e表达率测定

2%胰酶消化实验组及对照组细胞，将细胞滴加在多聚赖氨酸打底的载玻片上，推片，凉干后，CD49e抗体1∶100稀释，具体按APAAP试剂盒说明书进行操作，每张玻片在200倍光镜下，计数上、下、左、右四个区域，100个细胞中呈棕色之细胞数，一式三份。

1.4 RPMI-8226细胞培养液中免疫球蛋白测定

12000r/min离心收集上述实验及对照组细胞培养液，按ELIAS试剂盒说明书进行测定，一式三份。

1.5 XBP-1u蛋白表达测定

用细胞刮刮取上述实验组与对照组的RPMI-8226细胞，置EP管内，震荡混匀后置4℃、30分钟，取匀浆置离心管中12000r/min离心20分钟。取上清液测定蛋白含量，尔后用蛋白提取液将蛋白浓度均调至3mg/ml。将该组织液经100g/L SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，电转于PVDF膜，50g/L脱脂奶粉的TBST溶液封闭，经一抗及二抗孵育后，化学发光法显色，图像分析系统拍摄并用Quantity One软件将特异条带灰度数字化。

XBP-1u表达水平的相对值(XBP-1u蛋白表达系数)为XBP-1u蛋白条带灰度与内参蛋白β-actin蛋白条带灰度比值。(XBP-1u蛋白表达系数=XBP-1u蛋白积分光密度/β-actin蛋白积分光密度)。

1.6 统计学处理

实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，实验结果采用均数±标准差(x－±s)描述，三组资料各指标的比较采用单因素方差分析，两辆比较采用SNK法。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RPMI-8226细胞CD49e表达率

对照组细胞CD49e表达率为7.8% ±2.3%，衣霉素处理48小时实验组CD49e表达率为25.3%±3.1%，衣霉素处理72小时实验组CD49e表达率为43.6% ±3.3%，对照组与两实验组有显著差异(p＜0.01)。

2.2 RPMI-8226细胞培养液中免疫球蛋白:

对照组培养上清液免疫球蛋白轻链含量为(182±25)mg/L，衣霉素处理48小时实验组为(311±19)mg/L，衣霉素处理72小时实验组为(405±23)mg/L。对照与两实验组差异均有显著性(p＜0.01)。

2.3 XBP－1u蛋白表达

对照组、衣霉素处理48小时、72小时实验组XBP-1u蛋白表达，见图1。对照组XBP-1u蛋白表达系数为0.16±0.10，衣霉素处理48小时实验组XBP-1u蛋白表达系数为0.53±0.17，衣霉素处理72小时实验组 XBP-1u蛋白表达系数为0.93±0.15。对照与两实验组差异均有显著性(p＜0.01)。

3 讨论

多发性骨髓瘤是骨髓内浆细胞异常增生的一种恶性肿瘤，目前鲜有有效的治疗手段［3］。寻找安全有效的诱导分化治疗多发性骨髓瘤具有重要的临床意义。真核细胞的内质网承担着新生蛋白质的折叠、组装和运转，某些疾病时会产生未折叠或错误折叠蛋白，人类和小鼠细胞内存在一种机制，即通过调整内质网折叠蛋白的数量与加强折叠能力缓解内质网压力，该机制即UPR，UPR可用于保持内质网内稳定和阻止细胞凋亡，这机制可能是多种疾病的病原学基础［4］。有文献报道UPR在分泌抗体的细胞(如浆细胞)分化中起重要作用［5］。X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)作为一个转录因子参与 UPR的调节［6］。XBP-1s与 XBP-1u分别是XBP-1的剪切体与未剪切体，分别由376及260个氨基酸组成。有研究者［7］发现XBP-1s在骨髓瘤原代细胞中较正常浆细胞表达高，并在转基因小鼠的实验模型中发现XBP-1s可促进小鼠骨髓瘤的发病，故认为XBP-1s与骨髓瘤的发病相关。作者用衣霉素处理 RPMI-8226细胞后，RPMI-8226细胞的CD49e阳性率增加，其培养液中的免疫球蛋白轻链含量增高，且该现象随处理时间延长而更明显。CD49e阳性的骨髓瘤细胞是成熟细胞，能分泌更多的免疫球蛋白。该现象说明RPMI-8226细胞经小剂量衣霉素处理后，向成熟阶段分化。同时处理后的RPMI-8226细胞XBP-1u蛋白表达增高，XBP-1u可激活哺乳动物体内UPR，在UPR中起反馈调节，与细胞的分化相关［8］，显示该细胞向成熟阶段分化与XBP-1u蛋白表达增高引发UPR相关。综上所述，用小剂量的UPR诱导剂－衣霉素可使RPMI-8226细胞RPMI-8226细胞的XBP-1u蛋白表达增高，从而诱导该细胞向成熟细胞转化。

针对UPR途径靶向治疗多发性骨髓瘤是一新的治疗途径［9］。本实验结果亦显示该方法具有应用前景。

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［9］ 袁振刚，侯 健.未折叠蛋白反应与多发性骨髓瘤的治疗［J］.中华血液学杂志，2007，(28):715 －717