青蒿琥酯抑制MDA-MB-231细胞增殖的机制探讨

赵小波，幸天勇，高砚春

(川北医学院附属医院普外科，四川 南充 637000)

近年研究发现，雌激素阴性的较雌激素阳性的乳腺癌患者，肿瘤细胞的远处转移及侵袭能力更强，预后更差［1］。中药在提高癌症患者的生存质量、延长生存期等方面对雌激素受体阴性的乳腺癌治疗发展带来了新的契机。抗疟药青蒿琥酯(ART)是青蒿素衍生物，体内外实验证实对肝癌细胞有诱导凋亡的作用［2，3］，对结肠癌等55种细胞株均有细胞毒作用［4］。国内尚未见ART对雌激素受体阴性乳腺癌细胞影响的相关报道。本实验采用ER阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象，探讨ART抑制乳腺癌细胞作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及其配置

1.1.1 药物:ART由广西桂林第二制药厂生产。60 mg ART由5%碳酸氢钠1 ml配成储备液，－20℃保存。实验时用1640液稀释所需浓度，碳酸氢钠的终浓度＜0.09%

1.1.2 试剂:RPMI-1640(购于美国 Hyclone公司)，10%小牛血清(购于杭州四季青生物工程材料有限公司)，80 mg/L青霉素及120 mg/L链霉素(购于重庆医大附一院药房)，MTT(购于Sigma公司)。

1.1.3 免疫细胞化学:抗 Bax、抗 P21WAF1/CIP1、抗Bcl-2单克隆抗体(鼠抗人)、抗nm23多克隆抗体(兔抗人)及SP－9000(通用型)试剂盒，DAB试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。

1.2 细胞培养与处理:MDA-MB-231购于中科院上海生物研究所细胞库。用含10%小牛血清的1640培养基，在37℃、体积分数为5%的CO2孵箱中常规培养传代。细胞长至瓶底80% －90%时处于对数生长期，用0.05%胰酶和0.02%EDTA混合液消化后，5分钟800转离心，弃上清液，制成单细胞悬液即可备用。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖功能

1.3.1 实验分组:分为空白对照组、细胞对照组、溶剂对照组(0.09%NaHCO3)、药物组(2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)共9组。

1.3.2 步骤:将 5.0 ×104/ml浓度细胞加入96 孔板中，200μl/孔。培养24小时后，细胞贴壁，分别加入不同处理因素。每组设8个平行孔，在额定的时间取出培养板，吸去各孔培养液，换上200μl无血清1640并加入20μl的MTT(5 mg/ml)，轻振培养板，放回CO2孵箱中再培养4小时后，10分钟4000转离心，弃上清液，加DMSO200μl/孔，振荡器上振荡(5－10)分钟，空白调零，在微量板读数仪中测出每孔中600 nm处的OD值。并计算出ART对乳腺癌细胞的抑制率，重复3次。

乳腺癌细胞存活率=抗癌药物组吸光度值/细胞对照组吸光度值×100%

乳腺癌细胞抑制率=1－乳腺癌细胞存活率

1.4 免疫细胞化学检测

1.4.1 步骤:细胞爬片用PBS洗两次。过氧化氢孵育10分钟，TritonX－100/PBS穿孔，1%胰酶37℃消化30分钟，PBS冲洗后，滴加试剂1(正常三羊血清)封闭无关抗原，室温孵育(10－15)分钟，滴加适当一抗工作液，4℃冰箱过夜，滴加生物素二抗，室温孵育，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，DAB显色，复染，酸酒精褪色后封片。

1.4.2 判断标准:参照 Lessey［5］等判断标准，阳性细胞染成棕黄色，用HSCORE系数作半定量评分。计算出100个细胞中各强度的百分比，求HSCORE的值，并取其平均值。

1.5 统计学处理:实验采用SPSS 11.0软件包进行方差分析。MTT数据结果采用重复测量资料的方差分析法进行统计分析，免疫细胞化学检测结果采用单因素方差分析，p＜0.05有统计学意义

2 结果

2.1 MTT比色法结果:细胞对照组与NaHCO3组的吸光度值之间无显著性差异，说明溶剂NaHCO3液对MDA-MB-231细胞生长无影响。ART对MDAMB-231细胞有抑制作用，随作用浓度和作用时间的增加，药物的抑制作用加强，有剂量－效应和时间依赖的趋势，见表1。

表1 MTT法检测不同浓度、不同时间的青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞的作用

2.2 免疫细胞化学检测结果:乳腺癌细胞中Bcl-2蛋白质表达定位于细胞浆，PCNA蛋白质表达定位于细胞核，VEGF蛋白质在细胞浆和细胞核中都有阳性颗粒的表达。方差分析结果显示:ART2 μmol/L作用72小时后，MDA-MB-231细胞 PCNA、VEGF蛋白质的表达与细胞对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05)，BcL-2蛋白质的表达与细胞对照组相比差异无统计学意义，见表2。提示青蒿琥酯有下调PCNA、VEGF蛋白质的表达，抑制乳腺癌细胞株增殖的作用。

表2 ART影响增殖凋亡调控及转移相关蛋白质的表达

3 讨论

ER阴性乳腺癌多见于年轻、绝经前妇女，肿瘤分化程度低，病人预后较差。ART是目前最有效一线抗疟药，青蒿素控制疟疾的机制在于它能够与疟原虫体内的高浓度铁离子发生反应，产生自由基活性代谢物，损伤机体细胞膜结构和烷化生物大分子。肿瘤细胞分裂时需要大量铁离子才能复制DNA，故肿瘤细胞的铁含量明显高于正常细胞，因此可引入青蒿素有选择地杀死癌细胞［6］。Sertel［7］等证实ART对部分肿瘤细胞有杀伤及抑制增殖的作用，实验结果表明，ART有明显杀伤及抑制ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的作用，机制可能与下调PCNA、VEGF蛋白质的表达有关。如果临床将ART应用于ER阴性乳腺癌的化疗上有重要的意义。

PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，在DNA复制过程中起重要的调节作用，也是一种细胞周期调节蛋白，其表达随细胞周期而变化。PCNA表达量的增加同多种恶性肿瘤分化程度、组织学分级密切相关。如果PCNA不表达、低表达或无功能，将发生凋亡［8］。故目前许多学者已把PCNA的阳性表达作为乳腺癌一个有用的预后指标［9］。本实验结果表明20μmol/LART能明显抑制PCNA表达，从而降低DNA聚合酶δ的活性，抑制肿瘤细胞DNA的合成，这可能是ART抗肿瘤增殖作用的机制之一。

研究表明，许多肿瘤均表达VEGF及其受体。由于VEGF在肿瘤血管生成方面的重要作用，它已成为阻断肿瘤血管形成的理想靶点和早期乳腺癌的独立预后因子［10］。Mattern 等［11］认为 VEGF 不仅作为旁分泌因子可刺激血管内皮细胞增殖，同时还可能作为自分泌因子，通过直接作用于肿瘤细胞本身的VEGF受体而促进其生长。雌激素受体阴性的MDA-MB-231细胞中已经检测出VEGF-C的高表达［12］。本实验将20μmol/L ART作用MDA-MB-231细胞72小时后，免疫细胞化学结果显示细胞中VEGF蛋白表达下调，说明ART抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖还可能与其抑制VEGF表达，自分泌作用减弱有关，提示ART有潜在的抗血管生成活性［13］。

终上所述，ART有抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用，其机制可能于下调PCNA和VEGF蛋白质表达有关。ART可能对ER阴性乳腺癌的临床化疗提供新的治疗思路。

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