酶联免疫法检测生乳中三聚氰胺的研究

三聚氰胺又名氰尿酰胺，学名三氨三嗪（C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，常被用作化工原料。三聚氰胺是一种非蛋白质含氮化合物，属于难代谢物质，一旦进入人体或动物体内，能够不同程度地导致肾衰竭或者是死亡，还能导致结石诱发膀胱和泌尿系统疾病。但是，由于其含氮量高达66.67%，不法商贩抓住这一特点，向乳制品及饲料中添加三聚氰胺作为伪蛋白以提高产品的蛋白质含量，对食品安全造成很大危害。

近年来，发生在国内的“三鹿牌婴幼儿奶粉事件”以及美国的数起饲料致死宠物的事件，使三聚氰胺的检测成为全球关注的热点。目前，国际食品法典委员会对食品中三聚氰胺的允许含量设立了新的标准。标准规定：婴儿配方奶粉中三聚氰胺含量不得超过1 mg/kg，而其他食品或动物饲料中的三聚氰胺含量不得超过2.5 mg/kg。因此，如何高效快速地检测食品中三聚氰胺的含量成为保护消费者生命安全至关重要的问题。

目前，生乳与乳制品中三聚氰胺残留量检测的方法主要有液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）、气相色谱——质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）。快速检测法主要包括酶联免疫法、胶体金免疫层析法等，其中，酶联免疫法被广泛应用于三聚氰胺检测的筛选实验。本实验利用酶联免疫法对生乳进行了三聚氰胺含量的检测，为摸索三聚氰胺快速有效的检测方法提供了参考。

图1 三聚氰胺标准曲线图

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

酶标仪（北京朗普新技术有限公司）；涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂）；生化培养箱（宁波莱福科技有限公司）；微量移液器（瑞宁）；单道计时器；三聚氰胺酶联免疫试剂盒（北京望尔生物技术有限公司）；乙腈（分析纯）。

1.2 工作液配制

1.2.1 复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液按1:1体积比稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水），用于样本的复溶。

1.2.2 洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比稀释（1 份20×浓缩洗涤液+19 份去离子水），用于酶标板的洗涤。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

（1）取出生乳样品（编号1～25），待其至室温（25±2 ℃）后，摇匀。分别取400 μL生乳于离心管中，加入800 μL乙腈，涡动1 min。取100 μL上清液，再加入500 μL复溶工作液，混匀，取50 μL进行检测。

（2）另取3 份空白生乳样品（经实验室液相检测及气质联用确证后三聚氰胺含量为0的样品）400 μL，分别向其中加入10 μg/mL的三聚氰胺标准品0、20和50 μL，分别作为空白对照和2 个阳性添加（0.5、1.25 μg/mL）组，加入800 μL乙腈，涡动1 min。取100 μL上清液，再加入500 μL复溶工作液，混匀，取50 μL进行检测。

1.3.2 检测

（1）将所需试剂拿出，置于室温（25±2 ℃）平衡30 min以上。取出实验所需酶标板条，插入酶标板架上，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2～8 ℃的环境中。

（2）编号：将样品和标准品对应酶标板孔按序编号，每个样品和标准品做2 个平行孔，并记录标准孔和样品孔所在的位置。

（3）将50 μL各标准品工作液（样品溶液）分别加入对应的微孔中，每个孔中再加入50 μL酶标二抗工作液，最后加入50 μL抗体工作液，轻轻震荡混匀。盖好盖板膜置于25 ℃培养箱中，避光反应30 min。

（4）洗板：揭开盖板膜，甩干孔中液体，用洗涤工作液250 μL/孔，充分洗涤4～5 次，每次间隔10 s，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干。

（5）显色：加入底物A液50 μL/孔，再加底物B液50 μL/孔，轻轻震荡混匀，盖好盖板膜置于25 ℃培养箱中，避光反应15 min。

（6）测定：揭开盖板膜，在每个孔中加入50 μL终止液，轻轻震荡混匀。用酶标仪在双波长450 nm、630 nm下检测吸光度值，结果在终止后5 min内读取。

表1 三聚氰胺标准曲线检测结果

表2 样品检测结果

表3 空白对照及阳性添加样品回收率测定结果

1.3.3 计算

（1）百分吸光率的计算

各标准品（样品）的平均吸光度值除以零标平均吸光度值，再乘以100%，可以得到各标准品（样品）对应的百分吸光率。公式如下：

百分吸光率（%）=（标准品的平均吸光度值/零标的平均吸光度值）×100%

（2）标准曲线绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以三聚氰胺标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其相对应的稀释倍数，即得到样品中三聚氰胺的实际浓度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

所测得的标准品吸光度值及百分吸光率如表1所示。按上述方法计算，绘制成三聚氰胺标准曲线，如图1所示。同一组标准品吸光度值的离散系数均小于3%，说明本实验的重复性较好，符合试剂盒规定，而且各标准品与曲线的变异偏差小于0.4%，可见此标准曲线的准确率较高，依此曲线所测结果准确可靠。

2.2 样品及回收率测定结果

依据标准曲线可测得样品中三聚氰胺含量，空白对照结果及阳性添加样品回收率如表2、3所示。

从以上两表的结果显示，同一组样品的吸光度值的离散系数均小于10%，说明重复性很好。用阴性奶样作为阴性空白对照，并用不同浓度的三聚氰胺添加，作为阳性添加回收率的测定，实验结果如表3所示。空白对照组所得三聚氰胺含量为零，而2 个阳性添加样品所得平均回收率为97.7%，结果也比较理想，说明此实验的前处理方法及操作过程可信度较高，所得样品的结果准确可靠。根据标准规定：婴儿配方奶粉中三聚氰胺含量不能超过1 mg/kg，而其它食品或动物饲料中的三聚氰胺含量不能超过2.5 mg/kg。当三聚氰胺含量高于2.5 mg/kg即判定为阳性，表2中所示的26 个生乳样品中，三聚氰胺浓度均未超过68 μg/mL，其中20 号样品所测吸光度值高出零标吸光度值，出现超阴性现象，可能与奶牛的品种及体质不同有关。所测样品均符合国家规定，说明相关部门加大了对生乳环节的监管力度，使得违法添加现象大大减少。

3 讨论

3.1 以上实验结果表明，使用酶联免疫吸附法进行生乳中三聚氰胺含量的检测，具有快速、简便、准确、灵敏度高等特点。当检测量较大时，可以用酶联免疫吸附法先进行筛选，然后再用其它方法加以确证，这样可以大大节省时间和工作量，也有利于降低检测成本。

3.2 在整个实验中，温度对实验结果的影响相当大。实验前应将样品及试剂盒充分的温度控制在室温25 ℃，实验中温度保持在室温，所有孵育要在25 ℃恒温箱中进行，而且要避免光线照射，用盖板膜封好微孔板。

3.3 为避免交叉污染，在吸取不同试剂及样品时需要更换吸头。

3.4 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是测定程序中的要点。洗板过程中应避免出现板孔干燥的现象，排干后应立即进行下一步操作，以防曲线不成线性、重复性不好的现象出现。

3.5 试剂盒应保存于2～8 ℃，光线无法直射的环境中，使用后，应立即将所有试剂放回储存环境下。不要使用过期的试剂盒及试剂，不同批次的试剂盒不能交叉使用，否则会影响结果的灵敏度及准确性。

[1]薛树科，宋金凤，时丽艳，等. 乳制品中三聚氰胺检测研究进展. 河北化工，2010，33（9）：21-23.

[2]黄义彬，郑丽，欧翔，等. 高效液相法测定鸡蛋中三聚氰胺的残留量. 贵州农业科学，2009，37（6）：221-223.