血浆microRNAs在慢性肝损伤诊断中的应用研究

江 梅综述，万腊根审校

(南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

MicroRNAs(miRNAs)是内源性无编码功能的小分子单链RNA，长约21～23核苷酸，在转录后水平调节基因表达，参与机体各种重要的生理和病理过程。他们能够与目标mRNA的3＇-UTR区互补配对，导致蛋白翻译的抑制或mRNA的降解[1]。当它与mRNA不完全互补配对时，会抑制蛋白翻译的过程；而当它与mRNA完全互补配对时，则切割或降解mRNA[2]。有学者预计人类基因组中大约有800余个miRNA，虽占总编码RNA基因数量的1%，但调控着人类基因组中约20%～30%的基因[3]，1个miRNA可以调节多个蛋白编码mRNA，参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[4，5]，如胚胎发育、细胞生长和 凋亡、血细胞分化、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生和脂肪代谢等，随着研究的进展，对miRNA的研究从量的表象变化已经慢慢过渡到作用机制，进入了更深一步的研究。随着检测方法的进步，一个新的领域—循环 miRNA也逐渐成为科研的热点，成为潜在的检测标志物和治疗靶向点[6]。国内外很多文献指出血循环中的miRNAs在血浆和血清中非常稳定，不易被RNase降解，在极端的pH和反复冻融等条件下仍能保持稳定[7]。慢性肝损伤是一个多因素多阶段的病变过程，导致慢性肝损伤因素有：肝细胞炎症的变性坏死、肝纤维化、脂肪肝、肝硬变等等。慢性肝损伤发展后果多为形成肝硬化或肝癌，导致患者死亡。因此对慢性肝损伤病人的早期诊断尤为重要。由于miRNA的大小，数量，组织特异性，以及血浆中的相对稳定性，因此miRNA将是诊断和监测相应特异组织损伤的分子生物学标志物。本文就血浆miRNA在诊断慢性肝损伤中的应用研究作一综述。

1 血循环中m iRNA

肝脏组织细胞损伤、心肌细胞损伤等可导致某些特定循环 miRNAS如 miR-122、miR-l及 miR-208a显著升高[8]；结直肠癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等患者血浆或血清标本中也存在一些表达水平明显升高的循环miRNA[9]，据文献报道外周血循环miRNAs主要来源于凋亡或坏死细胞的主动释放，以及循环细胞的裂解或是miRNAs被包裹在外核体中经细胞分泌后释放入外周血[10]，值得注意的是，在肝脏和血浆中共存在约93种miRNAS，其中67种可见于血浆中，55种可见于肝组织中，其中8种在所有人的肝组织中能检测到，29种在所有人血浆中能检测到，只有5种在所有人的肝组织和血浆中都能检测到[11]，而miRNA在组织中高表达并不一定意味着血清中也高表达，Adaehi T等的检测结果显示miR574-3p和miR-146a在肝脏中的表达浓度也很高[12]，但未能进一步验证二者在肝病患者血清中亦呈显著高表达

2 血浆m iRNA与慢性肝炎

2.1 血浆miRNA与病毒性肝炎

我国是病毒性肝炎的高发区,尤其是慢性乙型肝炎，仅人群HBV感染率就高达60%，HBV携带者约1.2亿人，其中约20%的HBV感染者可能发展成为慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis B，CHB)，CHB已成为我国最广泛、最严重的传染病。 从已经发表的miRNAs 表达谱数据中：miR-199a、miR-126、miR-181a、miR-122、miR-21、miR-223、miR-125b、miR-222和miR-150等与肝脏病变相关，其中在肝脏组织中有较高表达水平的miRNAs有 miR-122、miR-126、miR-125b；原发性肝癌组织中上调或下调具有显著统计学意义的miRNAs有 miR-21、miR-125b、miR-223、miR-199a、m iR-222； 以及与病毒复制有关的 miRNAs有 miR-150、miR-181a[13-16]。贾音[17]等测定了这些miRNAs在慢性乙型肝炎肝损伤患者血浆样本中的表达情况，结果发现上述与肝病相关的9个 miRNAs有 3个(miR-199a、miR-125b和 miR–122)，其血浆中的表达量具有统计学意义，其中miR-122的变化最为显著。桂俊豪[18]等选择5种可能与肝病相关循环miRNAs(miR-885-5p，miR-215，miR-224，miR-574-3p和miR-146a)作为候选分子进行了初步验证，经过两次独立样本验证，最终结果显示，CHB患者血清中miR-885-5p的表达水平显著高于健康对照(P<0.01)，可能是由于机体免疫细胞可能存在持续的抗病毒活性并由此导致免疫细胞内源性miR-885-5p进入外周血。Xu[19]等用实时荧光定量RT-PCR检测48例慢性乙肝患者及101例肝癌患者血清中的miR-21miR-122miR-223，结果与健康人相比明显升高，且乙肝患者升高趋势要比肝癌患者明显，因此 miR-21，miR-122，miR-223 可作为慢性乙型肝炎肝损伤新的分子生物学标志。

2.2 血浆miRNA与酒精性肝炎、药物性肝炎

慢性肝炎不但包括慢性病毒性肝炎，还包括酒精性肝炎、药物性肝炎等等，酒精性肝损害主要是肝细胞氧化损伤，严重时可以诱发广泛肝细胞坏死。在西方国家，酗酒是发生慢性肝炎的首要原因，而酒精性肝损伤导致的酒精性肝硬化占肝硬化病人的一半以上。药物性肝病是由于药物治疗过程中肝脏受药物本身、代谢产物损害或发生过敏反应所致。其危害包括肝脏血管损害、诱导肝癌和促使肝硬化等[20]。在全球所有药物不良反应中，药物性肝病发生率为3%～9%[21]，Zhang[22]等建立了两种肝损伤小鼠模型(D-胺基半乳糖和酒精所致的肝损伤模型)来评估肝损伤，在D-胺基半乳糖所致的肝损伤模型中，早在腹腔注射0.5h后，就有血浆miR-122的增高，而且所有的小鼠均出现肝脏损伤的病理学变化，但是在此时间点，ALT的活性并没有发生改变。酒精所致的肝损伤模型与D-胺基半乳糖所致的肝损伤模型检测结果基本一致。而不同的是酒精所致的肝损伤模型中，0.5h并没有发现小鼠的肝脏有组织病理学改变，在酒精灌胃更长的时间内才有了肉眼可以观察到的病理学改变。与常规标志物ALT相比，在检测这些类型的肝脏损伤时，miR-122可能是一个更加灵敏的指标，因为miR-122的表达水平改变可能还更先于肉眼可见的组织病理学变化。Wang[11]等发现药物(对乙酰氨基酚)直接损伤肝细胞时大鼠血浆中循环miRNAs的表达谱发生明显变化，miR-192、miR-122在对照组和实验组的血浆及肝组织中也极大不同，其中miR-122可急剧升高400倍以上，而miR-710和miR-711的表达则明显下调。因此，循环miRNAS有望成为一类监测酒精性肝炎、药物性肝炎新型生物标志物。

3 血浆m iRNA与肝纤维化、肝硬化

肝纤维化是各种原因包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、中毒性肝病、自身免疫性肝病等导致肝脏损害后的一种修复过程,其结局是形成肝硬化,成为消化内科常见的难治疾病[23-24]。肝纤维化发生机制还未完全明了，肝星状细胞的激活是肝纤维化发生的早期关键事件，但最基本的细胞事件不外乎是细胞分化、增生和凋亡。 而这些正是miRNAs所调节的.Ji[25]发现 miR-27a、miR-27b 在肝星状细胞激活后明显上调，此外上调的还有miR-30a、miR-30c、miR-30d。miR-29a、miR-29b 表达下调也参与肝星状细胞激活[26]。至于肝纤维化过程中血浆microRNAs表达水平未见报道，有待进一步研究。在其发展为肝硬化后患者血浆中的microRNAs表达水平已有学者作出了验证。Gui[27]等发现肝硬化患者血清中miR-122的浓度较健康对照高了5.2倍，miR-192的浓度相应升高8.9倍，而血清中miR-885-5P的表达水平较健康组分别升高8.8倍(P＜0.01)，血清中miR-146a和miR-224的水平明显高于健康组(P＜0.05 和 P＜0.01)，而 miR-574-3p 的表达水平在健康组和肝硬化组未见统计学差异，miR-215的检出率太低而未作统计分析。因此，循环miR-122、miR-192、miR-885-5p 有望成为一类监测肝硬化的新型生物学标志物。

4 循环m iRNA检测

目前循环miRNA检测方法主要有：高通量测序法(Illumina/Solexa)、微阵列法、Northern blot法和荧光实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)法。目前也研究出了一些在此基础上的改良方法。如：LNA的探针杂交技术，核糖核酸酶保护法 (RNase protection assay，RPA)，微阵列芯片技术(Microarray)等。 循环miRNA表达与定量检测最常用的方法是 qRT-PCR法，此方法操作快速、简便、高效，而且具有很高的敏感性和特异性。目前miRNA检测的qRT-PCR方法主要是基于茎-环的RT-PCR方法 (stem-loop RTPCR)和基于 poly(A)加尾的RT-PCR方法。茎环反转录法的优势主要在于其反转录特异性较高，可反转录出与目的miRNA互补的一条或几条miRNA的cDNA第一链，然后通过特异的正向引物进行后续的荧光定量PCR检测。此法特异性强，但是引物设计较为繁琐和困难。加尾法反转录几乎将所有的成熟的miRNA加上Poly(A)的尾巴后进行反转录获得cDNA。通过特异的正向引物进行后续的荧光定量PCR检测，此法引物设计简便，通用性好。

5 展望

microRNAs(miRNAs)作为转录后水平调节基因，参与机体的各种重要的生理和病理过程。在不同生理状态和病理状态下，miRNA表达谱发生明显变化。目前，对于组织损伤后，循环中特异性的miRNA的研究并不多，研究并构建不同病理生理状态下循环miRNAS表达谱，对于疾病诊断、疗效判断及预后评估等无疑更具有吸引力[28]。检测循环中的miRNAs作为一种创伤性小，快速，简便的诊断方法，随着技术的成熟，想必将来会广泛地应用于临床诊断，尤其是监测早期的特异性的组织损伤。虽然不同疾病相关循环miRNA的种类、产生机制和作用还不完全清楚，但相信随着RNA、DNA和蛋白质三大生物分子学研究的深入，将会很好地解决这些还未明确的问题，为疾病的预测、诊断和治疗效果的监测开辟更广阔的前景。

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